新疆肉用綿羊抑制素βA基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

陳寶麒，趙宗勝，賈斌，楊華，張文祥

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003；2新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832000）

新疆作為我國(guó)五大牧區(qū)之一，是我國(guó)羊肉消耗量較大，并且擁有綿羊品種最多的省區(qū)。如具有良好放牧性能、增膘快、產(chǎn)肉多等特點(diǎn)的哈薩克羊，是新疆主要的肉用粗毛型地方品種；以及世界優(yōu)秀肉用綿羊品種之一的薩?？搜?，它具有生長(zhǎng)快、母性好、產(chǎn)肉率高等特點(diǎn)，許多新疆地區(qū)養(yǎng)殖戶將其與當(dāng)?shù)仄贩N雜交來(lái)提高產(chǎn)肉率［1］；而德中雜交羊則是以世界著名的肉毛兼用型德國(guó)美利奴羊?yàn)楦副?，以采食性好、生活力?qiáng)的中國(guó)美利奴羊?yàn)槟副镜碾s交品種，雜交后代具有產(chǎn)肉率高、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖力高以及耐粗飼等優(yōu)良的生產(chǎn)性能［2］。這3種羊以其耐粗飼、適應(yīng)性廣和產(chǎn)肉率高等特點(diǎn)，在新疆北疆地區(qū)被作為肉用綿羊大量養(yǎng)殖，但是這些肉用類型羊的產(chǎn)羔數(shù)量普遍較低，從而嚴(yán)重制約了新疆綿羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀遺傳力比較低，只有0．1左右，并且大多數(shù)綿羊都會(huì)受到季節(jié)性發(fā)情和環(huán)境等方面因素的影響，導(dǎo)致了較長(zhǎng)的時(shí)代間隔時(shí)間。所以對(duì)于影響產(chǎn)羔數(shù)基因的研究，就成為了研究者關(guān)注的問題。本實(shí)驗(yàn)選擇抑制素βA作為候選基因，檢測(cè)此基因的多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)。抑制素βA基因總長(zhǎng)度為1．16×105kb，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1．2kb，其中外顯子1和外顯子2長(zhǎng)度分別為387和889bp。

在1932年 McCullagh［3］提出“抑制素”這一概念之后，就受到了大量的關(guān)注。它是一種由性腺分泌的二聚糖蛋白激素，并且廣泛分布于肝臟、肺臟、腎上腺、腦、垂體等組織［4］。抑制素為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factors，TGF）超家族成員，其生理作用是能有效的抑制垂體促卵泡素（FSH）的合成與分泌，同時(shí)它也與卵巢發(fā)育和卵泡成熟也有一定的關(guān)系。國(guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)羔數(shù)性狀的研究中發(fā)現(xiàn)，這種與排卵相關(guān)的基因可以作為產(chǎn)羔性能的候選基因［5］?；瑖?guó)華［6］對(duì)5種山羊抑制素基因進(jìn)行了研究，結(jié)果表明抑制素基因多態(tài)性（128G＞A）顯著影響山羊產(chǎn)羔數(shù)。所以本研究選擇抑制素βA為候選基因，利用PCR－SSCP技術(shù)對(duì)抑制素βA基因5′調(diào)控區(qū)、外顯子1和外顯子2區(qū)域進(jìn)行單核苷 酸 多 態(tài) 性 （Single nucleotide polymorphism，SNP）分析，并探討其與哈薩克羊、薩?？搜蛞约暗轮须s交羊產(chǎn)羔數(shù)性狀之間的關(guān)聯(lián)，旨在為新疆肉用綿羊育種和養(yǎng)殖奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)羊全部來(lái)自于新疆第九師165團(tuán)，其中哈薩克羊110只，薩?？搜?1只，德中美利奴羊78只，每只羊靜脈采血5mL，肝素鈉抗凝－20℃凍存。用酚氯仿抽提血液全基因組DNA，溶于TE緩沖液，4℃保存。

1．1．2 主要試劑

康為世紀(jì)PCR預(yù)混液（Mix）、天根pGM－T載體連接試劑盒、天根膠回收試劑盒。

1．1．3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

針 對(duì) 抑 制 素 βA 序 列 （GenBank：NW＿004080167．1），用primer5．0設(shè)計(jì)包括5′調(diào)控區(qū)，外顯子1和外顯子2共5對(duì)引物，對(duì)上述綿羊抑制素βA部分序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物由華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

PCR反應(yīng)體系為15μL，體系包括：基因組DNA 0．5μL、上下游引物各0．5μL、康為世紀(jì)PCR預(yù)混液7．5μL、去離子水6μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性5min，94℃變性30s，復(fù)性30s（復(fù)性溫度見表1），72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．1．4 SSCP檢測(cè)

將3μL PCR產(chǎn)物和8μL上樣緩沖液（98%甲酰胺、0．025% 溴酚藍(lán)、0．025% 二 甲 苯 氰 及 10 mmol／L EDTA（pH 8．0））混勻，98℃變性10min，然后－20℃冰浴10min。

冰浴完成后，用交聯(lián)度（丙烯酰胺：甲叉又丙烯酰胺）為39∶1的10%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳：220V電泳10min清理泳道，然后將冰浴后的變性樣220V電泳10min，之后140V電泳12－16h，最后銀染顯色并置于凝膠成像系統(tǒng)，拍照保存，分析帶型。

1．1．5 克隆測(cè)序

對(duì)于有多態(tài)性的PCR擴(kuò)增片段，選取每個(gè)的基因型進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGM－T載體進(jìn)行連接反應(yīng)過夜，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌內(nèi)過夜培養(yǎng)。

挑取單克隆菌落至相應(yīng)抗性的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，再把擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送上海Ivitrogen公司測(cè)序。

1．1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過SSCP結(jié)果計(jì)算各種基因型的基因型頻率和等位基因頻率；以及群體雜合度（H）、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（E），并采用SPSS 17．0軟件的單因素方差分析（One－way ANOVA）及LSD法檢驗(yàn)基因型與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果與分析

2．1 PCR擴(kuò)增

設(shè)計(jì)的所有引物擴(kuò)增條帶都很清晰，通過2%瓊脂糖膠檢測(cè)，片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小一致，沒有非特異擴(kuò)增條帶，可以直接進(jìn)行SSCP分析。

2．2 SSCP分析

PCR－SSCP分析結(jié)果表明：針對(duì)外顯子1和外顯子2上設(shè)計(jì)的引物1－1、1－2、2－1、2－2均未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段的多態(tài)性位點(diǎn)，5′UTR區(qū)引物0－2擴(kuò)增片段檢測(cè)到存在多態(tài)性位點(diǎn)，而且在德中美利奴羊、薩?？搜蚝凸_克羊中都呈現(xiàn)3種基因型，分別定義為：AA、BB、AB（圖1）。

2．3 測(cè)序結(jié)果分析

選取基因型AA、BB、AB的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果顯示（圖2）：基因型BB和基因型AB與GenBan上NW＿004080167．1的綿羊序列一致。而基因型AA在外顯子1的－43和－44bp處發(fā)現(xiàn)C→A和G→A堿基突變（圖2A、B），在外顯子1的－38bp處發(fā)現(xiàn)C→A單堿基突變（圖2C、D），外顯子1的－25bp處發(fā)現(xiàn)C→G單個(gè)堿基突變（圖2E、F）。

2．4 抑制素βA基因3種類型肉羊的遺傳多態(tài)性

由表2可知：在哈薩克羊、薩?？搜?、德中雜交羊中AB基因型頻率最高，AA基因型頻率次之，BB基因型頻率最低，3種綿羊的等位基因A均比等位基因B的頻率高。

基因座位在每個(gè)群體中的雜合度、有效等位基因數(shù)、遺傳多態(tài)信息含量見表3。由表3可以得知哈薩克羊、薩?？搜?、德中雜交羊的遺傳多態(tài)參數(shù)，3種綿羊多態(tài)性信息含量分別為0．373、0．374、0．369，均處與0．25到0．5之間，表明該位點(diǎn)在以上3種類型綿羊中是中度多態(tài)。

2．5 抑制素βA基因多態(tài)性與3種類型綿羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

由表4可知：在哈薩克羊、薩?？搜蚝偷轮须s交羊中，抑制素βA基因的3種基因型產(chǎn)羔數(shù)總體趨勢(shì)AA＞AB＞BB，且在哈薩克羊和德中雜交羊中基因型AA產(chǎn)羔數(shù)與AB基因型和BB基因型的產(chǎn)羔數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），AB基因型和BB基因型的產(chǎn)羔數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。薩福克羊AA、BB、AB基因型整體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

3 討論

3．1 綿羊抑制素βA基因多態(tài)性

抑制素βA基因存在遺傳多態(tài)性［7］。本研究對(duì)哈薩克羊、薩?？搜?、德中雜交羊抑制素βA基因的5′調(diào)控區(qū)、外顯子1和部分外顯子2進(jìn)行了PCRSSCP分析。本研究結(jié)果顯示：3種綿羊的抑制素βA基因5′調(diào)控區(qū)具有多態(tài)性，存在4個(gè)堿基突變位點(diǎn)，有3種基因型，分別定義為AA、AB、BB，多態(tài)信息含量處于中度多態(tài)。經(jīng)克隆測(cè)序結(jié)果比對(duì)可知，基因型AB和BB的序列和GenBank上NW＿004080167．1公布的綿羊序列一致，而基因型AA發(fā)生堿基突變：在外顯子1的－43和－44bp中檢測(cè)到C→A和G→A的連續(xù)堿基突變，外顯子1的－38和－25bp處分別檢測(cè)到一個(gè)C→A和C→G的單堿基突變，而未發(fā)現(xiàn)莊海濱等［8］在綿羊抑制素βA基因多態(tài)性分析研究中外顯子1第－1位點(diǎn)G→A的單堿基突變位點(diǎn)。而在其他4對(duì)引物中，與莊海濱等［8］研究中外顯子1第260bp位點(diǎn)C→T的單堿基突變、外顯子2第499位點(diǎn)G→A的單堿基無(wú)義突變，以及索峰等［9］對(duì)巴美肉羊多態(tài)性分析中外顯子2第857bp位點(diǎn)G→A的單堿基突變位點(diǎn)不同，本研究以上3種羊外顯子1和部分外顯子2上均沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)。這可能是由于綿羊品種不同造成的少數(shù)堿基差異的現(xiàn)象。

3．2 抑制素βA基因與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)系

索峰等［9］對(duì)巴美肉羊抑制素βA基因多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制素βA基因是一個(gè)重要的影響巴美肉羊產(chǎn)羔數(shù)的基因。董李學(xué)等［10］在抑制素A基因遺傳變異與雙羔性狀的的研究中發(fā)現(xiàn)抑制素與雙羔性狀有關(guān)聯(lián)。彭志蘭等［11］對(duì)抑制素βA與青山羊高繁殖力的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，抑制素與青山羊高繁殖力有一定關(guān)系。

本研究將抑制素βA基因作為與綿羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)的候選基因進(jìn)行研究。針對(duì)抑制素5′調(diào)控區(qū)、外顯子1和部分外顯子2進(jìn)行PCR－SSCP分析。結(jié)果顯示哈薩克羊、?？搜?、德中雜交羊抑制素βA基因5′調(diào)控區(qū)均存在3種基因型，其中基因型AA存在堿基突變。3種綿羊的基因型頻率和平均產(chǎn)羔數(shù)總體趨勢(shì)AA＞AB＞BB，哈薩克羊和德中雜交羊的AA基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AB和BB基因型（P＜0．05），BB和AB基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），而在薩?？搜蚧蛐虯A、AB、BB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。哈薩克羊和德中雜交羊外顯子5′調(diào)控區(qū)的AA基因型綿羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于基因型AB和BB的產(chǎn)羔數(shù)，說明等位基因A相對(duì)于等位基因B為優(yōu)勢(shì)等位基因，從一定程度上預(yù)示著本實(shí)驗(yàn)中AA突變純合型與新疆地區(qū)哈薩克羊、德中雜交羊的產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)，值得做進(jìn)一步研究。

雖然本研究檢測(cè)到的堿基突變發(fā)生在外顯子5′調(diào)控區(qū)，不改變編碼的氨基酸，但這種連續(xù)和密集的堿基突變位點(diǎn)，很可能影響啟動(dòng)子區(qū)域的重要堿基改變，導(dǎo)致5′調(diào)控區(qū)核糖開關(guān)、小結(jié)構(gòu)元件以及內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等高級(jí)元件結(jié)構(gòu)的變化。這類元件主要作用是通過其結(jié)構(gòu)或特定蛋白與之相互作用來(lái)調(diào)控對(duì)應(yīng)mRNA的翻譯［12］。我們推測(cè)本研究中檢測(cè)到的突變位點(diǎn)可能通過影響這類元件結(jié)構(gòu)，致使抑制素βA基因mRNA轉(zhuǎn)錄本活性降低，導(dǎo)致抑制素βA基因表達(dá)量減少，使其對(duì)卵巢內(nèi)FSH拮抗作用減弱，最后獲得良好的卵泡質(zhì)量，使這種抑制素βA基因表達(dá)量減少的綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀顯著增高，即：AA基因型綿羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AB和BB基因型綿羊。這一結(jié)論只是根據(jù)有限的試驗(yàn)樣本和資料進(jìn)行推測(cè)，還需后期結(jié)合抑制素βA基因多態(tài)性與mRNA定量表達(dá)關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行進(jìn)一步研究。

由于綿羊產(chǎn)羔數(shù)是1個(gè)多基因參與調(diào)控的性狀，目前還未見其主效基因的報(bào)道，本研究單從抑制素βA這個(gè)基因的變化來(lái)闡述其與產(chǎn)羔數(shù)的規(guī)律和機(jī)制顯然不合理，所以本研究結(jié)果只能說明抑制素βA基因與哈薩克羊、薩?？搜蚝偷轮须s交羊的產(chǎn)羔數(shù)存在關(guān)聯(lián)，此次發(fā)現(xiàn)的抑制素βA基因5′UTR區(qū)的堿基突變與該基因?qū)ι鲜?種羊產(chǎn)羔數(shù)的調(diào)控有一定影響，其具體的影響機(jī)制和調(diào)控原理有待進(jìn)一步研究。

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