免疫金法快速檢測食品中的甲基對硫磷

邢麗杰，王遠(yuǎn)，羅小玲

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院／農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，石河子832000）

目前，果蔬中的農(nóng)藥殘留一直是公眾注目的焦點(diǎn)問題，我國每年有上百起農(nóng)藥污染農(nóng)產(chǎn)品引起急性中毒事件發(fā)生，嚴(yán)重影響消費(fèi)者身體健康，而高毒農(nóng)藥殘留對人體健康引起的慢性潛在危險也正日益引起重視，其中有機(jī)磷類農(nóng)藥的品種最多、用量最大［1］，農(nóng)藥殘留問題嚴(yán)重威脅人類及周圍的生存環(huán)境，并已發(fā)展成為國內(nèi)外共同的社會問題［2－3］，急需建立起蔬菜水果中農(nóng)藥殘留量快速分析檢測方法。

甲基對硫磷是一種產(chǎn)量大、應(yīng)用廣的高毒有機(jī)磷酸酯類殺蟲劑，由于其毒性較高，近年來已在蔬菜、水果和中藥材等作物上禁止使用，但并未禁止生產(chǎn)及在其他經(jīng)濟(jì)作物上的使用在蔬菜生產(chǎn)中仍存在農(nóng)藥亂用、濫用的現(xiàn)象，在農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易、食品安全的監(jiān)督檢測中，甲基對硫磷仍然是日常檢測的重要污染物［4］。目前，國內(nèi)對甲基對硫磷的研究主要集中在微生物降解、多孔材質(zhì)吸附解毒、風(fēng)險評估、在植物中的殘留動態(tài)和效應(yīng)生物標(biāo)志物等方面，檢測方法則主要集中在氣相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜－質(zhì)譜法［5－10］，而免疫學(xué)檢測方法則很少，而且僅停留在酶聯(lián)免疫（ELISA）分析方法上，并未見有膠體金法檢測的報道。這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，儀器方法準(zhǔn)確但是需要配置昂貴的大型分析儀器，同時對人員的技術(shù)素質(zhì)要求極高，一般單位很難達(dá)到，且不適于快速、簡便地進(jìn)行大批量樣品的檢測，ELISA方法只適合大批量篩選樣品，因為做一個樣品和做幾十個樣品均需要做整套流程，所用時間相同，并且用到的試劑較多，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作繁瑣、費(fèi)時，影響因素也較多。

本研究選取甲基對硫磷作為研究對象，基于膠體金免疫層析技術(shù)，研制出從食品樣本中快速檢測甲基對硫磷殘留的免疫金為例快速測試試紙條，旨在為免疫學(xué)方法快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 材料與試劑

Balb／c小鼠（6周齡）購于新疆自治區(qū)預(yù)防疾病控制中心；甲基對硫磷人工抗原、甲基對硫磷單克隆抗體細(xì)胞株（自制）。

甲基對硫磷、聚乙二醇（PEG）20000、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑（Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA、北京新經(jīng)科生物公司）；羊抗鼠IgG（上海生物工程有限公司）；硝酸纖維膜（NC膜、Millipore公司）；膠金墊、樣品墊、濾紙、吸水紙及PVC底板（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；抗甲基對硫磷單克隆抗體自制。

1．1．2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（450nm，美國Thermo公司）；渦旋振蕩器；冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；37℃恒溫箱（上海博訊）；50、100、1000μL微量移液器（德國eppendorf公司）；八道移液器（美國Thermo公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；超純水儀（成都超純科技有限公司）；磁力攪拌器等。

1．2 方法

1．2．1 試驗步驟

1．2．1．1 單抗細(xì)胞株的復(fù)蘇與鑒定

取出冷凍保存的甲基對硫磷單抗細(xì)胞株保存管，立即放入37℃水槽中快速解凍，融化后緩緩加入含有預(yù)熱至37℃DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)（稀釋比例為1∶10～1∶15），混合均勻后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換新鮮預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞貼壁情況。細(xì)胞復(fù)蘇后每天觀察細(xì)胞的生長狀況，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔底1／3～1／4時，用間接ELISA法測定細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價。

1．2．1．2 單克隆抗體的制備

觀察甲基對硫磷單克隆抗體細(xì)胞株的生長狀況，待細(xì)胞生長鋪滿瓶底時即可用于腹水的制備，將培養(yǎng)好的單抗細(xì)胞用生理鹽水懸浮后計數(shù)，取Balb／c小鼠每只腹腔注入1×106個細(xì)胞，15d后當(dāng)小鼠腹部明顯膨大，瀕臨死亡時采集腹水，并將腹水以1000r／min離心10min，棄去上層的脂肪層，收集中間層液體，即為含有甲基對硫磷單克隆抗體的腹水，用飽和的硫酸銨初步純化，取proteinG親和層析柱用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗平衡，親和柱平衡好后將經(jīng)鹽析初步純化的甲基對硫磷單抗注入，上樣結(jié)束后用PBS緩沖液洗脫雜蛋白，再用pH 2．7的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫結(jié)合在柱上的甲基對硫磷單克隆抗體，收集并中和至pH 7．0，得到的IgG用0．2mol／L的PBS進(jìn)行透析，置于4℃?zhèn)溆茫⒂米贤馕辗y定抗體的濃度。

1．2．1．3 金標(biāo)記抗體條件的篩選

調(diào)整甲基對硫磷的單抗溶液濃度為1mg／mL，取96孔酶標(biāo)板編號后，每孔加入100μL直徑為10 nm、pH為9．0的膠體金溶液，再加入濃度為1mg／mL的甲基對硫磷抗體溶液，體積分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μL，并作陰性對照，室溫下放置30min，再向各孔加入10%的NaCl溶液30 μL，保持紅色不變的為抗體膠體金穩(wěn)定值，選擇最小抗體濃度值為抗體標(biāo)記的用量值。

1．2．1．4 金標(biāo)抗體的制備

取1只試管，加入直徑為10nm的膠體金溶液5mL，調(diào)整pH值為9．0，加入甲基對硫磷的單抗振蕩15min，再繼續(xù)加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其終濃度為1%，繼續(xù)振蕩15min；振蕩結(jié)束后10000r／min離心20min，移除上清；用BL溶液重新溶解至原體積的10%，即為金微粒標(biāo)記好的單抗。

1．2．1．5 試紙條的組裝與條件選擇

將甲基對硫磷人工抗原和羊抗鼠二抗在NC膜上劃線，分別作為檢測T線與質(zhì)控C線，37℃干燥2h；同時將甲基對硫磷金標(biāo)抗體點(diǎn)在膠金墊上，37℃真空干燥1．5h；將NC膜、膠金墊、樣品墊、濾紙、吸水紙及PVC底板組裝好后，切成4mm寬后裝卡，置于錫箔袋中，加干燥劑密封，于4℃保存。

對甲基對硫磷人工抗原取0．5、0．7、1．0、1．5 μg／mL的系列濃度進(jìn)行試紙條的組裝與檢測實驗，對質(zhì)控線羊抗鼠二抗取0．5、0．7、1．0、1．5μg／mL的系列濃度，結(jié)合時間取0．5、1．0、1．5、2．0h進(jìn)行試紙條的組裝與檢測實驗，甲基對硫磷單抗與膠金墊的結(jié)合量取5、10、15、20μL／cm，結(jié)合時間篩選取0．5、1．0、1．5、2．0h進(jìn)行試紙條的組裝與檢測實驗，分別選取最佳的實驗條件。

1．2．1．6 檢測方法

將試紙條平放，往樣本池中加入8 0μL樣本，反應(yīng)10min后判讀結(jié)果。當(dāng)樣品中甲基對硫磷的質(zhì)量濃度大于10μg／kg時，則質(zhì)控C線顯色且檢測T線不出現(xiàn)條帶，結(jié)果為陽性；當(dāng)樣品中甲基對硫磷質(zhì)量濃度小于10μg／kg時，質(zhì)控C線顯色且檢測T線出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陰性；若質(zhì)控C線不顯色，說明操作不當(dāng)或者試紙條失效。

1．2．1．7 樣本前處理方法

蔬菜樣本的處理：取切碎的蔬菜組織樣本于均質(zhì)機(jī)以10000r／min均質(zhì)1min；稱取1．0g均質(zhì)物置于離心管中，加入4mL乙腈，渦旋振蕩5min；室溫條件下4000r／min離心5min，移取1．25mL上清液至離心管中，氮吹至干；向殘留物中加入1mL正己烷，渦動30s，再加入1mL PBS，振蕩1min；室溫條件下4000r／min離心10min，取下層液相用于檢測。

1．2．2 評價實驗

1．2．2．1 靈敏度

將甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5、8、10、15、20、50、100μg／kg，另設(shè)陰性對照，用試紙條進(jìn)行檢測。每組做3個重復(fù)實驗，根據(jù)結(jié)果判斷試紙條靈敏度。

1．2．2．2 樣本檢測限

對黃瓜、西紅柿和上海青，3種陰性樣本中添加甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，添加量分別為25、50、100、200 μg／kg，另設(shè)陰性對照，按1．2．1．7節(jié)所述方法對樣品進(jìn)行處理，用試紙條進(jìn)行3次重復(fù)檢測，根據(jù)實驗結(jié)果判定樣本檢測限。

1．2．2．3 特異性與重復(fù)實驗

將對硫磷、辛硫磷、氧化樂果、毒死蜱4種有機(jī)磷藥物分別稀釋成10、100、1000、10000μg／kg后用試紙條檢測。不同樣本每個濃度做3次重復(fù)，根據(jù)實驗結(jié)果判定試紙條的特異性。

取試紙條對陰性及10μg／kg甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行50次重復(fù)測定，根據(jù)實驗結(jié)果判定試紙條的重復(fù)性。

1．2．2．4 穩(wěn)定性試驗

將試紙條和金標(biāo)記抗體分裝后置于37℃做穩(wěn)定性試驗。在第1、3、5、7天時分別取出，進(jìn)行競爭反應(yīng)，觀察顏色的變化。

2 結(jié)果與分析

2．1 制備甲基對硫磷單克隆抗體

將冷凍保存的甲基對硫磷單抗細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后每天觀察細(xì)胞的生長狀況，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔底1／3～1／4時，用間接ELISA法測定細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價為1∶256，結(jié)果見表1。

將培養(yǎng)的甲基對硫磷單抗細(xì)胞重懸后注入小鼠的腹腔，待小鼠產(chǎn)生腹水后收集并進(jìn)行純化，并用PBS透析，得到的甲基對硫磷單抗用紫外吸收法測得所得濃度為4．43mg／mL，結(jié)果見表2。

2．2 試紙條條件的確定

通過抗體標(biāo)金量的實驗測定，確定直徑10nm的膠體金溶液pH為9．0時，最佳抗體標(biāo)金量為25 μg／mL。

通過試紙條測試實驗條件的篩選，確定甲基對硫磷人工抗原與NC膜結(jié)合的最佳使用濃度為0．5 μg／mL，質(zhì)控線羊抗鼠IgG最佳使用濃度為1．0 mg／mL，最佳結(jié)合時間為2．0h，抗甲基對硫磷金標(biāo)抗體的包被量為10μL／cm，最佳結(jié)合時間為1．0h。

2．3 靈敏度

實驗結(jié)果如表3所示，該試紙條檢測含量在10 μg／kg以上的甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品時，結(jié)果為陽性；檢測含量在10μg／kg以下的甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品時，結(jié)果為陰性。根據(jù)實驗結(jié)果判定該試紙條的靈敏度為10μg／kg。

2．4 樣本檢測限

經(jīng)測定，黃瓜、西紅柿、青菜，3種陰性樣本使用試劑條進(jìn)行檢測時，檢測T線和質(zhì)控C線均顯紅色，檢測結(jié)果如圖1所示，結(jié)果判定為陰性；陰性樣本中甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)量為50μg／kg時，檢測T線不顯色，結(jié)果判為陽性。根據(jù)結(jié)果判定該試紙條對蔬菜樣本中甲基對硫磷的實際檢測限為50 μg／kg。

2．5 特異性

對選取的4種有機(jī)磷類藥物進(jìn)行檢測后，結(jié)果顯示本方法只對對硫磷有交叉反應(yīng)，對其它3種藥物均沒有交叉反應(yīng)，表明該試紙條特異性強(qiáng)。用試紙條方法檢測甲基對硫磷，多次重復(fù)測定結(jié)果一致，表明該試紙條批內(nèi)、批間測定差異小，重復(fù)性良好。

2．6 穩(wěn)定性

采用加速試驗進(jìn)行穩(wěn)定性研究。37℃保存7d相當(dāng)于4℃保存6個月。研究發(fā)現(xiàn)，膠體金標(biāo)記抗體在37℃保存7d后檢測，檢出限沒有變化，說明金標(biāo)抗體在4℃條件下能夠穩(wěn)定保存6個月。

3 討論

本研究成功研制出了甲基對硫磷快速檢測試紙條。該試紙條應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)原理，樣本中的甲基對硫磷在流動的過程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，從而抑制抗體和NC膜檢測線上甲基對硫磷人工抗原的結(jié)合，該試紙條反應(yīng)時間小于7min，靈敏度達(dá)10μg／kg，樣本實際檢測限為50μg／kg，與對硫磷有一定的交叉反應(yīng)，分析原因是因為對硫磷與甲基對硫磷官能團(tuán)中只有1個甲基的差別，結(jié)構(gòu)極其類似，所以會存在交叉反應(yīng)，屬于正?，F(xiàn)象，但與其他3種有機(jī)磷藥物并無交叉反應(yīng)，表明其特異性很好，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、易于判定、經(jīng)濟(jì)實用等優(yōu)點(diǎn)。

使用氣相色譜法分析測定甲基對硫磷：回收率為70%～120%時，加標(biāo)量在100～500μg／kg，在選擇二倍信噪比方法時，檢出限為9μg／kg，美國EPA方法為10μg／kg，歐盟和IUPAC為20μg／kg［11］，SPE－液相色譜檢出限為460μg／kg［12］，熒光光度法測定水中的檢出限為5μg／kg［13］，酶聯(lián)免疫方法檢測甲基對硫磷的檢出限為5～30μg／kg［14－15］。本研究制備的試紙條可適用于多種蔬菜樣品的檢測，其靈敏度達(dá)10μg／kg，樣本實際檢測限為50μg／kg，比較之下，在實際樣本的檢測中該試紙條的靈敏度比液相色譜高，比氣相色譜法、熒光光度法和酶聯(lián)免疫法較低，但差距不大。雖然氣相色譜方法更加準(zhǔn)確，靈敏度更好，但高昂的價格和高技術(shù)要求限定其只適合于實驗室鑒定，該檢測方法低廉的成本直接決定其可大面積推廣和應(yīng)用，ELISA方法雖然成本很低，但所用到的試劑多，操作繁瑣，而該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是整個過程只需一步加樣，反應(yīng)7min即可判讀結(jié)果，既可以做1個樣品液可以大批篩選，非常適合農(nóng)貿(mào)市場大批量樣品的現(xiàn)場快速入場初篩和家庭自用。

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