人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的研究進(jìn)展

李翰翔，丁曉玲，徐茂義，沈忠飛 (嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下可分化為多種功能細(xì)胞，根據(jù)發(fā)育階段不同分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow－derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的一類多能干細(xì)胞，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層來源組織細(xì)胞分化的能力。BMSCs獲取簡(jiǎn)便，分離培養(yǎng)較容易，移植排斥反應(yīng)較弱，植入反應(yīng)較為理想。哺乳動(dòng)物來源的BMSCs是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，相關(guān)研究證實(shí)其有強(qiáng)烈的成骨潛能［1］，因此BMSCs被認(rèn)為是一種理想的骨組織工程種子細(xì)胞，其成骨誘導(dǎo)成為近來研究的熱點(diǎn)。

1 BMSCs的特性及分化潛能

1.1 BMSCs的生物學(xué)特性:間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來源于中胚層，主要存在于器官間質(zhì)和結(jié)締組織中，在骨髓組織中含量最多，統(tǒng)稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。BMSCs具有成體干細(xì)胞的兩個(gè)特征:一是能在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地自我復(fù)制，即長(zhǎng)期自我更新;二是能分化為具有一定形態(tài)特征和特定功能的成體細(xì)胞，代替因疾病或損傷凋亡的細(xì)胞，在一定程度上維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。此外，BMSCs還具有異質(zhì)性、貼壁性、可移植性和快速克隆的能力［2］。BMSCs細(xì)胞表面可表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD124等，其中粘附分子 CD44是多種配體的受體，其分別在骨和骨髓中對(duì)構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)起重要作用，BMSCs對(duì)CD44的強(qiáng)表達(dá)表明其在骨髓中有助于骨髓基質(zhì)的形成和功能的發(fā)揮。但BMSCs的抗原表型不具有特異性，在肌肉細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面均可找到同類抗原。有研究顯示BMSCs在傳代培養(yǎng)時(shí)保持著細(xì)胞的端粒活性和染色體核型［3］，表現(xiàn)出高度擴(kuò)增能力。BMSCs在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為梭形、多角形和紡錘形，包括體積較大的成熟細(xì)胞，體積較小的無顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞共三個(gè)細(xì)胞亞群。

1.2 BMSCs的分化潛能:有學(xué)者認(rèn)為BMSCs最重要的生物學(xué)特性是多向分化潛能，大量體外實(shí)驗(yàn)表明BMSCs可分化為骨、骨髓基質(zhì)、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶和脂肪等多種間充質(zhì)組織［4］。Kadiyala等［5］將BMSCs在體外擴(kuò)增后置于羥基磷灰石上培養(yǎng)，細(xì)胞產(chǎn)生骨基質(zhì)并向骨細(xì)胞分化。有研究證實(shí)BMSCs還具有向心肌細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能。Tomita等［6］向低溫造成心肌梗死的動(dòng)物模型的心肌瘢痕組織中注射大鼠骨髓細(xì)胞，移植細(xì)胞在5 w后分化出了肌管，并且表達(dá)了肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白，提示BMSCs已向心肌細(xì)胞分化。更為重要的是在移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞間存在間隙連接蛋白connexin－43，表明二者間有縫隙連接形成［7］，這一結(jié)構(gòu)證明BMSCs具有依賴環(huán)境的定向分化能力。細(xì)胞周期研究顯示，大多數(shù)BMSCs處于G0/G1期(約90%)，只有少數(shù)細(xì)胞正在活躍地復(fù)制，高比例的G0/G1期細(xì)胞暗示BMSCs具有高度分化潛能。

2 BMSCs的分離和培養(yǎng)

BMSCs最易從骨髓中分離獲取，但其含量不高，在全骨髓中的比例約為1∶1×105，且細(xì)胞數(shù)量隨體質(zhì)的衰弱或年齡的增加而逐漸減少［8］。因此，在離體條件下將 BMSCs進(jìn)行分離、純化和擴(kuò)增十分重要。篩選BMSCs的方法在Friedemtein法基礎(chǔ)上經(jīng)過改良，主要有3種方式:①貼壁篩選法:利用造血細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中呈懸浮生長(zhǎng)而BMSCs呈貼壁生長(zhǎng)的特性，即底物黏附特性將二者分離。②密度梯度離心法:利用BMSCs與其他細(xì)胞的密度差異，采用Fieoll液或Pereoll液將其分離出來。③免疫學(xué)分離法:采用免疫磁珠法或流式細(xì)胞儀法，依據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞特性進(jìn)行篩選。

培養(yǎng)BMSCs最常用的是DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)培養(yǎng)基(含有10% ～20%的胎牛血清 FBS，100 U/ml鏈霉素，100 U/ml青霉素)。Lennon 等［9］發(fā)現(xiàn)適量的胎牛血清有利于維持BMSCs的貼壁、擴(kuò)增及多系分化潛能，10%的胎牛血清最有利于BMSCs的培養(yǎng)，濃度過高時(shí)容易使細(xì)胞過早老化。培養(yǎng)所采用的細(xì)胞密度一般為5×105/ml。BMSCs可以反復(fù)傳代，傳代細(xì)胞能保持多向分化潛能，不發(fā)生自然分化，傳代后的BMSCs細(xì)胞純度可達(dá)到95%［10］。有學(xué)者嘗試用新的方法來分離培養(yǎng) BMSCs，Encina等［11］用抗STRO－1包被的免疫磁珠從人的骨髓基質(zhì)中分離培養(yǎng)BMSCs，其中98%的細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。Oreffo等［12］采用Hop－26選擇性分離培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，在Hop－26陽(yáng)性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量呈典型成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞克隆。

3 BMSCs的成骨誘導(dǎo)

自BMSCs被發(fā)現(xiàn)起，多數(shù)都是對(duì)其向骨組織分化的研究，決定BMSCs分化方向的關(guān)鍵則是誘導(dǎo)分化的條件［13］。刺激 BMSCs向成骨細(xì)胞分化的物質(zhì)有許多［14－15］，如 TGF－β、BMP、IGF－1等。目前BMSCs成骨定向誘導(dǎo)分化的方法有以下幾種:

①化學(xué)誘導(dǎo):是目前最常用方法，經(jīng)典培養(yǎng)體系中含地塞米松、β－甘油磷酸鈉和抗壞血酸，可誘導(dǎo)人BMSCs定向分化為典型成骨細(xì)胞，此種細(xì)胞堿性磷酸酶活性較高，能產(chǎn)生I型膠原，分泌骨連接素和骨橋素。地塞米松可刺激堿性磷酸酶活性，誘導(dǎo)成骨分化［16］。Ogston等［17］發(fā)現(xiàn)地塞米松濃度在10－8mol/L這一濃度級(jí)別具有較高的成骨誘導(dǎo)效率。β－甘油磷酸鈉可為成骨細(xì)胞提供磷離子，促進(jìn)鈣鹽沉積。抗壞血酸能促進(jìn)膠原合成，刺激堿性磷酸酶和ATP酶活性。

②中藥誘導(dǎo):淫羊藿、柚皮苷、黃芪、龜甲等可單獨(dú)或與化學(xué)培養(yǎng)液共同發(fā)揮作用誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞。

③成骨細(xì)胞誘導(dǎo):通過成骨細(xì)胞與BMSCs共同培養(yǎng)，以直接接觸的方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞融合和增殖，實(shí)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)。

④物理誘導(dǎo):采用電磁場(chǎng)、體外沖擊波等物理機(jī)械刺激，通過MAPK通路使BMSCs向成骨細(xì)胞分化。Wang等［18］發(fā)現(xiàn)低能量沖擊波可激活BMSCs內(nèi)網(wǎng)狀激活系統(tǒng)，誘導(dǎo)TGF－β1的產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)骨小結(jié)形成。Takahashi［19］發(fā)現(xiàn)沖擊波作用可促使成骨細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的相關(guān)基因，這種蛋白對(duì)于促進(jìn)成骨起重要作用。

⑤轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo):向靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入具有成骨作用的基因，該基因在病變區(qū)轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為成骨相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)自身成骨。

4 BMSCs成骨特性鑒定

目前對(duì)于BMSCs成骨特性的鑒定尚無特異性手段，多采用以下方法:①采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)特性觀察或采用掃描電鏡對(duì)有載體依附的BMSCs進(jìn)行細(xì)胞和組織形態(tài)學(xué)觀察;②免疫組化檢測(cè)Ⅰ型膠原;③Von Kossa′s礦化結(jié)節(jié)染色;④Gomori鈣－鈷法檢測(cè)堿性磷酸酶;⑤原位雜交檢測(cè)骨連接素和骨橋素;⑥MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性反應(yīng)。

5 問題與展望

盡管BMSCs的相關(guān)研究已進(jìn)行了幾十年，也取得了一定進(jìn)展，國(guó)外學(xué)者已建立了兔、鼠及人的BMSCs培養(yǎng)體系，并將其成功誘導(dǎo)為多種結(jié)締組織。但BMSCs相關(guān)研究本身還不夠全面和系統(tǒng)，目前仍處于探索階段。據(jù)殷曉雪等［20］研究發(fā)現(xiàn)，人BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)可產(chǎn)生連續(xù)的礦化結(jié)節(jié)，而鼠MSCs在相同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)呈島狀且不連續(xù)，與未礦化細(xì)胞群間隔分布，提示種屬間的差異在BMSCs的研究中是不容忽視的，也表明從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過渡到臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步深入研究。同時(shí)，人們對(duì)BMSCs的分化機(jī)理尚未完全掌握，尤其是BMSCs的定向分化和制備過程不易調(diào)控。此外，對(duì)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的鑒定以及細(xì)胞與支架材料的融合等諸多問題仍有待人們?nèi)ソ鉀Q。

近年來，利用干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化骨組織成為生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是獲取大量的、活力和功能良好的種子細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，骨髓來源的MSCs分裂增殖能力強(qiáng)，分化潛能大，免疫排斥反應(yīng)較弱，取材方便，無倫理問題的限制，且多次傳代后成骨能力不會(huì)減弱，因此BMSCs很適合作為骨組織工程的種子細(xì)胞。同時(shí)，作為細(xì)胞表型分化尚不成熟的前體干細(xì)胞，BMSCs在同種異體移植后排斥反應(yīng)也比較弱，是一種理想的替代治療的靶細(xì)胞。隨著相關(guān)研究的深入，BMSCs在細(xì)胞替代治療和組織工程中有著廣闊的應(yīng)用前景。

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