羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)乙型肝炎表面抗原定量檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià)及性能驗(yàn)證

吳文清，黃志基（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）檢測(cè)的臨床應(yīng)用極為廣泛。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，HBsAg的定量檢測(cè)也以逐步應(yīng)用于臨床，對(duì)判斷乙型肝炎病毒（HBV）感染患者免疫應(yīng)答狀態(tài)、抗病毒療效評(píng)價(jià)及制訂治療方案等方面有著重要意義［1］。早期用于HBsAg定量檢測(cè)的方法僅能檢測(cè)原倍血清，且檢測(cè)線性范圍很小，檢測(cè)上限一般為130～250IU／mL，使其臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限。羅氏公司Elecsys MODULAR ANALYTICS E－170電化學(xué)免疫分析系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱E－170分析系統(tǒng)）可用于HBsAg定量檢測(cè)，且檢測(cè)上限可達(dá)52 000IU／mL。筆者根據(jù)美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（CAP）和ISO15189對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的管理要求和實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的要求［2－3］，對(duì)E－170分析系統(tǒng)進(jìn)行了 HBsAg檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià)和性能驗(yàn)證，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本來(lái)源 收集高、低濃度水平新鮮血清標(biāo)本用于批內(nèi)重復(fù)性測(cè)定和批間重復(fù)性測(cè)定。

1.2 儀器與試劑 羅氏公司E－170分析系統(tǒng)及配套HBsAg定量檢測(cè)試劑（批號(hào)165611）、HBsAg定標(biāo)液（批號(hào)165611）和其他試劑。以自制混合血清（高值6 157.77IU／mL，低值1 580.88IU／mL）作為質(zhì)控品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本檢測(cè)每日校準(zhǔn)、定標(biāo)后進(jìn)行高、低值質(zhì)控品檢測(cè)，共20d，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，確認(rèn)本系統(tǒng)質(zhì)控范圍。每次檢測(cè)標(biāo)本前先進(jìn)行質(zhì)控品檢測(cè)，確認(rèn)在控后進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)。

1.3.2 不精密度評(píng)價(jià) （1）批內(nèi)不精密度評(píng)價(jià)：選擇高濃度、低濃度混合血清1份，連續(xù)檢測(cè)20次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和批內(nèi)變異系數(shù)，評(píng)價(jià)批內(nèi)不精密度。（2）批間不精密度評(píng)價(jià)：選擇高濃度混合血清1份，分裝為20份，－30℃保存，每天檢測(cè)1份，連續(xù)檢測(cè)20d，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和批間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)批間不精密度。

1.3.3 分析測(cè)量范圍（AMR）驗(yàn)證 按EP6－P2文件要求［4］，取低濃度（22.075IU／mL）和高濃度（48 158.25IU／mL）血清各1份，按體積比3∶1、1∶1、1∶3混合，制備混合血清標(biāo)本3份，連同未混合的血清標(biāo)本共5份，每份標(biāo)本檢測(cè)4次，計(jì)算均值，以理論值和測(cè)試均值作回歸分析，計(jì)算回歸方程，按α＝1.00±0.05、r≥0.97為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行AMR驗(yàn)證。

1.3.4 可報(bào)告低限值（LoQ）驗(yàn)證 選擇HBsAg濃度接近1∶400稀釋檢測(cè)低限值（20IU／mL）的血清樣本1份，每天檢測(cè)1次，連續(xù)檢測(cè)12d，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，以變異系數(shù)不超過(guò)20%為標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證LoQ。

1.3.5 儀器自動(dòng)稀釋正確度驗(yàn)證 選擇11份HBsAg濃度即可用原倍血清檢測(cè)，又可自動(dòng)稀釋檢測(cè)的標(biāo)本，分別檢測(cè)原倍血清和1∶400自動(dòng)稀釋血清，計(jì)算其偏差，以偏差小于20%為標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證自動(dòng)稀釋正確度。

2 結(jié) 果

2.1 不精密度評(píng)價(jià) 高濃度標(biāo)本（26 222.35IU／mL）批內(nèi)不精密度評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)差為520.76IU／mL，變異系數(shù)為1.99%；低濃度標(biāo)本（40.69IU／mL）標(biāo)準(zhǔn)差為0.91IU／mL，變異系數(shù)為2.23%。高濃度標(biāo)本（27 005.80IU／mL）批間不精密度評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)差為853.59IU／mL，變異系數(shù)為3.16%；低濃度標(biāo)本（42.47IU／mL）標(biāo)準(zhǔn)差為1.71IU／mL，變異系數(shù)為4.03%。

2.2 AMR驗(yàn)證 5份待測(cè)標(biāo)本理論值由高到低依次為48 158.25、36 124.21、24 090.16、12 056.12、22.075IU／mL，實(shí)測(cè)值均值由高到低依次為48 158.25、34 527.00、22 511.00、10 805.75、22.075IU／mL，經(jīng)回歸分析計(jì)算回歸方程為Y＝0.997 1X－815.92，r2＝0.998 1，符合判斷標(biāo)準(zhǔn)的要求，故本系統(tǒng)檢測(cè)HBsAg的AMR為22.075～48 158.25IU／mL。

2.3 LoQ驗(yàn)證 12次檢測(cè)結(jié)果均值為24.905IU／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為0.934IU／mL、變異系數(shù)為3.751%，符合判斷標(biāo)準(zhǔn)的要求，故可認(rèn)為本系統(tǒng)檢測(cè)HBsAg的LoQ為24.905IU／mL。

2.4 儀器自動(dòng)稀釋正確度評(píng)價(jià) 11份標(biāo)本原倍和1∶400稀釋液檢測(cè)結(jié)果均值分別為77.8、83.3IU／mL，偏差值的均值為7.06%，符合判斷標(biāo)準(zhǔn)的要求，故本系統(tǒng)自動(dòng)稀釋檢測(cè)HBsAg具有較高正確度。

3 討 論

E－170分析系統(tǒng)為封閉檢測(cè)系統(tǒng)，所有試劑和耗品均為羅氏公司產(chǎn)品，說(shuō)明書提供的所有參數(shù)均為廠家在國(guó)外的最佳條件下進(jìn)行試驗(yàn)所獲得的，而每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的外部條件與最佳條件存在較大差異，包括水質(zhì)、電壓穩(wěn)定性、環(huán)境溫濕度、人員操作習(xí)慣等均有所不同。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都必須對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)建立符合自身?xiàng)l件的方法學(xué)參數(shù)。此外，說(shuō)明書只提供了原倍血清的方法學(xué)參數(shù)，即0.05～130IU／mL之間檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證，而需要進(jìn)行HBsAg定量檢測(cè)以監(jiān)控療效患者，其血清HBsAg濃度往往達(dá)到該濃度范圍的幾十至幾百倍，即需進(jìn)行儀器1∶400稀釋。因此，本次方法學(xué)評(píng)價(jià)主要基于1∶400稀釋度，評(píng)價(jià)結(jié)果為：HBsAg定量檢測(cè)批內(nèi)精密度（以變異系數(shù)表示）分別為2.23%和1.99%，批間精密度（以變異系數(shù)表示）分別為4.03%和3.16%，均與說(shuō)明書提供的參數(shù)基本一致，符合美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）文件EP5－A，完全能夠滿足臨床診斷的要求［4－5］。

AMR驗(yàn)證的目的是驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)的最高檢測(cè)值和高低檢測(cè)值之間是否呈線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為每個(gè)系統(tǒng)建立各自的線性參數(shù)，不應(yīng)直接引用廠家提供的線性范圍［5－6］。本次驗(yàn)證HBsAg定量檢測(cè)的最高檢測(cè)值為48 158.25IU／mL，且高低檢測(cè)值呈線性關(guān)系。

目前多是實(shí)驗(yàn)室將說(shuō)明書提供的分析靈敏度作為檢測(cè)系統(tǒng)的最低檢測(cè)限，這不僅存在著上述的系統(tǒng)差異，更可能存在著引用錯(cuò)誤。按最新的觀點(diǎn)，功能靈敏度才是檢測(cè)系統(tǒng)的最低檢測(cè)限，但大部分廠家未提供功能靈敏度，即使提供，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)建立自己的靈敏度或?qū)ζ溥M(jìn)行驗(yàn)證。本次驗(yàn)證結(jié)果表明，E－170分析系統(tǒng)HBsAg定量檢測(cè)的功能靈敏度為24.91 IU／mL。

當(dāng)臨床標(biāo)本的檢測(cè)值超過(guò)線性范圍時(shí)，臨床一般要求報(bào)告確切值。因此，對(duì)于超過(guò)線性范圍的標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)室一般會(huì)進(jìn)行稀釋后檢測(cè)。但是否存在稀釋效應(yīng)，應(yīng)通過(guò)試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。臨床可報(bào)告范圍評(píng)價(jià)就是了解檢測(cè)項(xiàng)目的最大可稀釋度［7］。本次驗(yàn)證結(jié)果顯示，以1∶400稀釋時(shí)，原倍血清和稀釋血清檢測(cè)結(jié)果的整體偏差為7.02%，與理論值基本相符。因此，可認(rèn)為廠商提供的E－170分析系統(tǒng)HBsAg定量檢測(cè)最高1∶400稀釋度可以使用。

綜上所述，E－170分析系統(tǒng)定量檢測(cè)HBsAg的性能符合CAP、IOS15189實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可及臨床的要求；部分性能指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果與廠家提供的參數(shù)不完全相同，說(shuō)明廠家提供的方法學(xué)參數(shù)不能全部直接引用，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的分析性能指標(biāo)。

［1］Chan HLY，Wong VWS，Tse AML，et al.Serum hepatitis B surface antigen quantitation can refluent hepatitis B virus in the liver and predict treatment response［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5（10）：1462－1468.

［2］ College of American Pathologists.Clinical immunology checklist［M］.Washington，USA：CAP，2006.

［3］叢玉隆，馮仁豐，陳曉東.臨床實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2004：72－73，89－102，123－129.

［4］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP5－A Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1999.

［5］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP6－P2Evaluation of linearity of quantitative analytical methods.Proposed guideline－second edition［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1996.

［6］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP9－A Method comparison and bias estimation using patient samples［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1995.

［7］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP10－A Preliminary evaluation of quantitative clinical laboratory methods［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1998.