酶聯(lián)免疫吸附試驗在實驗室應用中的質(zhì)量控制

吳正銅 綜述，韋理關 審校（廣西壯族自治區(qū)環(huán)江縣疾病預防控制中心 547100）

質(zhì)量控制是運用現(xiàn)代科學管理技術和數(shù)據(jù)統(tǒng)計學的方法，使實驗室的檢驗結(jié)果控制在允許的范圍內(nèi)所采取的一系列有效措施。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、快速穩(wěn)定及不需要特殊設備等優(yōu)點。ELISA已廣泛應用于各種抗原和抗體測定，但其影響因素較多，其中任何因素控制不當都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生嚴重影響。因此，必須加強ELISA檢測的全面質(zhì)量控制，才能保證實驗室檢測結(jié)果的準確可靠。綜合目前國內(nèi)外總結(jié)資料，結(jié)合作者工作經(jīng)驗，現(xiàn)將ELISA使用過程中需要加以控制的關鍵因素綜述如下。

1 人員素質(zhì)

實驗室檢驗人員必須熟練掌握ELISA的原理、檢測試劑和檢測儀器的性能、操作方法、實驗室質(zhì)量控制及生物安全等方面的知識，有較豐富的免疫血清學理論知識和操作經(jīng)驗，具有獨立分析判斷與處理檢測結(jié)果異常值的思維能力。人員素質(zhì)的高低將直接影響檢測結(jié)果及影響有關數(shù)據(jù)的處理能力。

2 實驗環(huán)境

2.1 室內(nèi)溫度對檢測結(jié)果的影響非常大，特別是試劑的室溫平衡，因此實驗室應安裝冷暖空調(diào)，使環(huán)境溫度控制在20～25℃。

2.2 實驗室環(huán)境中氯離子對TMB顯色也有很大影響，當氯離子濃度增高時，可使TMB顯色，從而造成假陽性，這就要求實驗室不能用含氯離子的消毒劑[1]。

3 儀 器

3.1 移液器 移液器應送計量檢定校準部門檢定或校準。同時實驗室也應不定期的使用萬分之一的電子天平進行蒸餾水稱量法校準，誤差控制在0.10以內(nèi)。

3.2 水浴箱 水浴箱應送計量檢定校準部門校準。溫度的高低將直接影響試劑和樣品的反應速度，應嚴格控制水浴箱內(nèi)的溫度，注意水浴箱蓋的密閉性，往往水浴箱溫度計所指示的溫度與箱內(nèi)的實際溫度有一定的誤差，必要時水浴箱內(nèi)應放置溫度計加以核準。

3.3 洗板機 根據(jù)各種洗板機要求不同進行必要的調(diào)試，包括洗板機的針頭吸水高度、放水高度、泵的壓力、加液量、浸泡時間、洗滌次數(shù)及檢測試劑對洗板機的其他要求。同時，洗板時應注意管道的氣泡及針頭的通暢情況，最好進行預洗。

3.4 酶標儀 酶標儀應定期送計量檢定校準部門校準，同時加強對光學部分的維護，如用無水乙醇擦拭濾光片，防止發(fā)霉[2]。

4 標 本

患者標本中可能會含有干擾ELISA測定導致假陽性和假陰性結(jié)果的干擾因素，可分為兩大類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。

4.1 內(nèi)源性干擾因素

4.1.1 類風濕因子（RF） 患者體內(nèi)的RF能顯著干擾ELISA檢測，其中IgM和IgG型RF可以與ELISA檢測中的捕獲抗體及標記二抗的Fc段直接結(jié)合，從而導致假陽性或假陰性結(jié)果。解決辦法：（1）在使用RF吸附劑后再檢測，可有效糾正錯誤結(jié)果；（2）稀釋標本后再檢測這對 HAV－IgM、HBVIgM和TORCH的IgM抗體尤為有用。

4.1.2 補體 ELISA試驗固相抗體和酶二抗可因其在固相吸附及標記過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其Fc段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露出來，使C1q可以將二者連接起來，從而造成假陽性；另一方面，固相抗體也會因為活化補體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力，從而引起假陰性結(jié)果或使定量測定結(jié)果偏低。解決方法：（1）用終濃度10～40mmol/L處理標本，滅活補體；（2）56℃加熱血清30min使C1q滅活[3]。

4.1.3 異嗜性抗體 人血中含有抗嚙齒類動物（如鼠、馬、羊等）Ig抗體，即天然的異嗜性抗體，其通過非競爭機制干擾ELISA檢測，造成檢測的假陰性或假陽性。解決辦法：可在標本稀釋液或待檢標本中加入過量的動物Ig，封閉可能存在的異嗜性抗體。

4.1.4 人體動物抗體（HAAAs） HAAAs是當機體受到外源異種蛋白（如鼠、牛馬、羊等）抗原刺激，激發(fā)機體免疫應答，導致人體產(chǎn)生HAAAs。標本內(nèi)的HAAAs結(jié)合了試劑中所用動物源抗體形成復合物阻斷了標本中分析物與之的特異性結(jié)合，導致檢測結(jié)果異常增高或降低，甚至出現(xiàn)假陽性或假陰性，使實驗檢測結(jié)果與臨床診斷不相符[4]。

4.1.5 交叉反應物質(zhì) 待測標本中存在的類地高辛、甲胎蛋白（AFP）樣物質(zhì)等，是一些與檢測的靶抗原有交叉反應的物質(zhì)，容易造成假陽性結(jié)果[5]。

4.2 外源性干擾因素

4.2.1 標本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血，如標本溶血，標本中血紅蛋白釋放出來，血紅蛋白含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此在經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）為標記酶的ELISA測定中，吸附于固相，從而與后面加入HRP底物顯色反應，呈假陽性[6]。

4.2.2 細菌污染 樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌的污染，因為一是細菌生長分泌一些酶可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二是一些細菌的內(nèi)源性酶（如大腸桿菌的β－半乳糖苷酶）本身會對相應酶作標記的測定方法產(chǎn)生特導性干擾。

4.2.3 標本保存不當 標本在2～8℃下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接ELISA測定中會導致本底過深，造成假陽性結(jié)果。血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存1周，樣本長時間保存，應在－70℃以下保存。冷凍保存的血清標本必須注意避免因停電造成的反復凍融，標本的反復凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價下降，從而引起假陰性結(jié)果。

4.2.4 標本凝固不全 標本采集后應使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶有分離膠的采集管或于采集管中加入適當?shù)拇倌齽@樣有利于血清完全分離，否則血清中有纖維蛋白原非特異性吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。標本在保存中如出現(xiàn)非細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清液檢測。

5 試劑使用和保管

優(yōu)質(zhì)的試劑是保證檢驗質(zhì)量的基礎。雖然國家采用批檢的形式對ELISA試劑嚴格把關，但不同廠家的試劑在性能上仍存在較大差異，試劑的質(zhì)量在很大程度上決定了檢測水平，因此，在使用之前必須對試劑進行嚴格把關。

5.1 選擇靈敏度高，特異性強，精密度好，穩(wěn)定性和安全性能好且經(jīng)濟實惠的試劑。

5.2 保存試劑的冰箱應經(jīng)常檢查儲存溫度并做好記錄，冰箱應避免頻繁開關，在試驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫放置20～30min，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質(zhì)分子的均勻分布。

5.3 配試劑所使用的蒸餾水或去離子水應保證質(zhì)量。

5.4 當試劑盒以鄰苯二胺（OPD）為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配制，顯色反應過程需避光。

5.5 根據(jù)蛋白質(zhì)在冷凍過程中出現(xiàn)蛋白分子分布改變的特點，試劑在使用前要充分混勻。未用完的試劑和質(zhì)控品要密封并及時放回冰箱保存。

5.6 不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，這樣才能避免試劑批號改變而重新建立質(zhì)量體系及重新評估試劑的復雜過程，并能保證結(jié)果的穩(wěn)定性[7]。

6 加血清樣本及反應試劑

6.1 加樣時應將標本加在微孔反應板底部，同時吸頭不要接觸微孔反應板底部，每次加不同的標本均需更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。

6.2 加樣速度不能太快，速度要均勻，角度要垂直，力度要一致，避免加在孔壁上部和2個孔之間，防止濺出或產(chǎn)生氣泡，造成結(jié)果偏移。

7 溫 育

溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的因素，因此在操作過程中一定要注意如下幾點。

7.1 測量溫育的溫度要用水銀溫度計 溫箱內(nèi)的溫度應恒定在（37±1）℃，盡量少開溫箱門，溫育時微孔反應板不要疊加，嚴格按試劑盒說明書控制溫育時間，不能人為延長或縮短溫育時間；微孔反應板溫育時要加貼封片，這樣可以防止孔內(nèi)液體成分蒸發(fā)或水珠等雜質(zhì)滴入孔內(nèi)影響檢測結(jié)果。封片不能重復使用，避免交叉污染。

7.2 要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間 一般來說，加完樣品和反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱時，孔內(nèi)溫度從室溫升至所需溫度需要一定時間，尤其是室溫較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫過程可能還比較長，要等到微孔板的孔內(nèi)溫度升至所需溫度時才開始計時，否則容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本假陰性出現(xiàn)。

7.3 邊緣效應的排除 為了保證好的測定效果，避免“邊緣效應”，可采用水浴的溫育方式，讓微孔板浮于水面上?；?qū)⒔杆募啿挤湃胍淮箫埡谢蛞粷窈兄校湃霚叵?，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布接觸，以及水溶箱或溫盒內(nèi)的高溫度而使反應溶液的溫度迅速升至37℃。

8 洗 板

8.1 洗滌是ELISA不同于均相免疫學檢測技術的一大特征，洗滌在整個ELISA反應過程中雖不是一個反應步驟卻非常關鍵。其目的是將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成分分離開來，以保證ELISA測定的特異性。用HRP為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%山梨醇－20的中性磷酸鹽緩沖液，山梨醇－20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機制是借助其疏水基團與經(jīng)疏水性相互作用，被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附。同時在其親水基團與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進入液相，這樣就可以達到去除掉非特異吸附成分的目的。由于抗體或抗原的包被通常也是在堿性條件下與固相的疏水基相互作用而被動吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，如果山梨醇－20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限。

8.2 配制洗滌液需要用新鮮、干凈、無菌、無污染的蒸餾水或去離子水配制，洗滌液應現(xiàn)用現(xiàn)配，盛放洗滌液的塑料容器應經(jīng)常用清洗劑徹底清洗干凈后方可使用，洗板時應保證洗滌液注滿微孔反應板各孔。洗完板后微孔反應板在吸水紙上輕輕拍干[5]。

8.3 ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板，無論何種洗板方式都應該嚴格控制洗板次數(shù)，增加洗板次數(shù)會造成部分與固相結(jié)合的抗原抗體脫離，從而影響檢測的靈敏度，使樣本檢測的吸光度值偏低，造成假陰性[8]。減少洗板次數(shù)會造成未與固相結(jié)合的抗原抗體未能完全被洗掉，從而引起假陽性。在向板內(nèi)注液時應避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會因為洗滌液難以進入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機洗板時，要保證洗板機上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，要求洗板后殘液小于2μL，即人工扣板墊紙不濕，要注意加注洗液的探針孔的堵塞問題以及液體吸加的有效性，假陽性往往與洗板不徹底有很大關系。

9 顯 色

9.1 大多數(shù)ELISA商品試劑盒選用HRP作為標記酶，HRP可催化的底物為過氧化氫，參加反應的顯色供氫體有OPD、鄰聯(lián)甲苯胺及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等。操作時應注意各試劑盒顯色劑不能混用，添加順序不能顛倒，不能濺出孔外[9]。在以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則是提供的底物為A和B 2瓶應用液，A液為H2O2，B液為TMB。TMB是一種供氫體的染料，在HRP催化下，提供氫給H2O2，自身被氧化成藍綠色，加入含有硫酸的終止劑，降低pH，即可使藍色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，產(chǎn)物可穩(wěn)定90min，在波長為450nm處有最大消光系數(shù)。

9.2 在加入底物開始顯色反應前，最好先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液體各加1滴于清潔孔或試管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說明底物已變質(zhì)，不能使用，在以TMB為底物的整個顯色反應過程無需避光。

9.3 酶結(jié)合物不耐干燥，特別是在較高的溫度下更易失活，加入底物前，甩干的反應板在空氣中暴露的時間長短會影響時間結(jié)果，時間越長，則A值越低，因此甩干后的反應板應盡快滴加底物[10]。

10 比 色

ELISA比色結(jié)果必須通過酶標儀進行檢測，不可用肉眼判斷結(jié)果，因為不同個體色覺存在差異，難以保證檢測結(jié)果。正確使用酶標儀應注意下面2點。

10.1 在實驗室進行ELISA測定時，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，由于所使用的波長不同，前者450nm，后者492nm，因此一定注意酶標儀的波長是否調(diào)至合適和使用濾光片是否正確。

10.2 酶標儀最好使用雙波長進行測定，一般不必設空白孔，在敏感波長450nm和非敏感波長630nm下各測定一項，敏感波長的吸光度測定值為樣本酶反應特異顯色的吸光度及板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和，非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測定的吸光度即為臟物的吸光度值，最后酶標儀給出的數(shù)值為敏感波長的吸光度值與非敏感波長下的吸光度值差。因此，雙波長比色測定具有能排出由微孔板本身，板孔內(nèi)標本的非特異吸收，指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點。

11 結(jié)果的判定與報告

11.1 結(jié)果判定 ELISA測定按其表示結(jié)果的方式分為定性和定量測定，定性測定只是對標本是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的結(jié)論，分別用“陽性”和“陰性”來表示，結(jié)果的判定要嚴格依據(jù)試劑盒本身提供的臨界值cut off值進行結(jié)果判斷。定量測定需要制備標準曲線，根據(jù)標準曲線計算結(jié)果。

11.2 注意鉤狀（HOOK）效應 HOOK效應是指免疫檢測中抗原抗體濃度比例不合適而致檢測結(jié)果呈陰性的現(xiàn)象[11－12]。即被檢物質(zhì)濃度過高，過量的未被捕獲的抗原與檢測抗體發(fā)生結(jié)合，阻斷了捕獲抗原－抗體－檢測抗原抗體復合物的形成，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。對待HOOK效應要注意幾點：（1）關注患者的臨床診斷和其他實驗室檢查；（2）警惕任何異常的測定值或模式；（3）使用免疫滲透層析法快速驗證；（4）盡可能使用二步法進行檢測；（5）用健康人血清或生理鹽水10倍系列稀釋再檢測[13－14]；（6）另外有文獻報道 ELISA 孵育過程中適當振蕩也可消除 HOOK 效應[15]。

11.3 灰區(qū)的問題 通常情況下ELISA結(jié)果報告方式為“陰性”或“陽性”，在二者之間有一條明確的分界線，也就是陽性判定臨界值cut off值，對于樣本吸光度值（A）高于cut off值判斷為陽性，相反則判斷為陰性，然而在實際工作中經(jīng)常會出現(xiàn)樣本A值位為cut off值附近的數(shù)值，即ELISA檢測的 “灰區(qū)”。目前市場上抗原抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及到“灰區(qū)”的設置，僅僅依靠cut off值來決定感染的有無，作者在實際工作中發(fā)現(xiàn)，處于cut off值附近的標本重復性很差，很容易引起醫(yī)療糾紛。因此對于檢測結(jié)果處于“灰區(qū)”的人員要采取復查制度或用確認試驗來加以確證[16]。

12 質(zhì)量控制圖

目前在臨床檢驗實驗室中，ELISA檢測多采用Lever－Jennings質(zhì)控圖法進行質(zhì)控，但是由于某些實驗室檢測的樣本量較少而且頻次較低，常常采用“即刻法”結(jié)合Lever－Jennings質(zhì)控圖的方法進行質(zhì)控[17]。在每項試驗中除了試劑盒附帶的陰陽性對照外，還要選擇至少2個室內(nèi)質(zhì)控品，一個為弱陽性的質(zhì)控品的吸光度接近cut off值，S/cut off值應在2～4，另一個為陰性質(zhì)控品。認真分析每次失控的原因，定期對各項檢測的均值和變異系數(shù)等進行比對分析，及時發(fā)現(xiàn)檢測過程的偏離情況，采取適當?shù)拇胧﹣硖岣邫z測的可靠性。

綜上所述，盡管ELISA操作簡單，但可影響ELISA檢測的因素很多，分布在整個檢測過程。世界衛(wèi)生組織專家曾對ELISA的評價認為“ELISA作為免疫診斷應用是一個好方法，但要做好它不容易”[18－20]。因此必須不折不扣地全面加強各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，當出現(xiàn)實驗室檢測結(jié)果與臨床診斷不相吻合時要及時進行溝通，共同查找其中的原因，判斷是否存在某些干擾因素，并采取適當方案重新檢測，才能得到準確可靠且滿意的檢測結(jié)果。

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