耐碳青霉烯銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制和傳播機(jī)制研究＊

鄭 芬，芮勇宇（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，廣州 510515）

隨著抗生素的大量使用，臨床耐碳青霉烯銅綠假單胞菌日漸增多，給臨床抗感染治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［1］。銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，本研究主要探討碳青霉烯酶、可移動耐藥元件整合子Ⅰ和插入序列共同區(qū)（ISCR1）與耐藥性的關(guān)系，并采用腸桿菌科間重復(fù)一致性序列（ERIC）－聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對臨床分離的59株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌進(jìn)行同源性和傳播機(jī)制研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定 收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2011年1～12月臨床分離的碳青霉烯耐藥的銅綠假單胞菌（排除重復(fù)菌株）共59株，其中25株來自于呼吸科、18株來自于外科重癥監(jiān)護(hù)病房、16株來自于神經(jīng)內(nèi)科，這些菌株均分離于下呼吸道感染患者的痰液。所有分離的菌株采用BD Phoenix100儀器進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素藥敏試驗(yàn)采用K－B法，藥敏紙片購自英國Oxoid公司。用 WHONET5.6分析菌株藥敏情況。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）。

1.2 儀器與試劑 德國Eppendorf公司的PCR擴(kuò)增儀，Bio－Rad公司的凝膠成像儀。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、Hinf I均為TaKaRa公司產(chǎn)品。Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、10%十二烷基磺酸鈉（SDS）購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 細(xì)菌DNA模板制備 將菌株接種5mL LB肉湯，35℃培養(yǎng)18h。取菌液1 000μL，12 000r/min離心5min，細(xì)胞沉淀物以無菌磷酸鹽緩沖液洗滌，SDS－蛋白酶K裂解后，利用酚－氯仿進(jìn)行抽提，乙醇洗滌后用TE緩沖液（10mmol/L Tris，1mmol/L乙二胺四乙酸）溶解DNA沉淀，于－20℃保存。

1.4 Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)研究 先采用PCR對59株銅綠假單胞菌進(jìn)行整合酶I基因擴(kuò)增，陽性菌株進(jìn)一步對其可變區(qū)即整合子Ⅰ進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物和反應(yīng)體系均參照文獻(xiàn)［2］。可變區(qū)陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性核酸片段長度多態(tài)性分析（RFLP），所用反應(yīng)體系均為20μL，含10×H Buffer 2μL，Hinf I 5U，5μL陽性PCR產(chǎn)物模板，加入滅菌去離子水至20 μL。37℃酶切消化1h后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并挑選不同譜型的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因公司測序。

1.5 ISCR1結(jié)構(gòu)研究 先采用PCR對59株菌進(jìn)行ISCR1基因擴(kuò)增，陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增ISCR1可變區(qū)基因，所用引物均參照文獻(xiàn)［3］。

1.6 復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu)研究 對于整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)均陽性的菌株，先針對整合子Ⅰ的3′保守區(qū)和ISCR1的5′保守區(qū)設(shè)計(jì)共同區(qū)引物，引物1為5′－GTA TTG CGC CGC TCT TAG AC－3′，引物2為5′－AAA CCA GCA TGG TTG GCT AC－3′。若擴(kuò)增陽性，再針對整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物3為5′－TCC CGA GGT CAC CAA GAT－3′，引物4為5′－TTA CTC CCA AGG GTT CCA G－3′，擴(kuò)增從整合子Ⅰ可變區(qū)到ISCR1可變區(qū)之間的片段。

1.7 常見碳青霉烯酶基因檢測 PCR檢測碳青霉烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和SPM。所用引物均參照文獻(xiàn)［1，4］，各基因的陽性對照株均為本課題組PCR檢測后經(jīng)測序驗(yàn)證過的臨床分離株。各基因陽性的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因測序驗(yàn)證。

1.8 ERIC－PCR基因分型 ERIC－PCR引物序列 ERIC－2：AAG TAA GTA ACT GGG GTG AGC G，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，26℃退火2min，72℃延伸1 min，4個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2 結(jié) 果

2.1 I類整合子結(jié)構(gòu) 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中，20株（34%）整合酶Ⅰ陽性，17株（29%）整合子Ⅰ可變區(qū)擴(kuò)增陽性，RFLP分型顯示，50株整合子Ⅰ陽性菌株共分為3個(gè)譜型分別測序。測序比對結(jié)果顯示，7株為A類型，攜帶氨基糖苷類耐藥（aacA4）；6株為B類型，攜帶氨基糖苷類耐藥（aadA7）；4株為C類型，攜帶氯霉素類和氨基糖苷類耐藥（catB3＋aacA4）基因盒。

2.2 ISCR1結(jié)構(gòu) 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中，9株（15%）ISCR1陽性，5株（8%）檢測到可變區(qū)陽性。RFLP分型顯示，5株為同一譜型，測序結(jié)果表明可變區(qū)攜帶基因盒喹諾酮耐藥（qnrA1）和β－內(nèi)酰胺類耐藥（ampR）。

2.3 復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu) 復(fù)雜性整合子驗(yàn)證結(jié)果顯示，1株整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)均陽性的菌株共同區(qū)擴(kuò)增陽性，進(jìn)一步針對整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增也為陽性，提示這株菌均攜帶一種復(fù)雜性Ⅰ類整合子，基因盒排列為catB3＋aacA4＋I(xiàn)SCR1＋qnrA1＋ampR。

2.4 常見碳青霉烯酶基因 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中3株檢出VIM－2基因，2株檢出IMP－1基因，未檢出其他碳青霉烯酶基因。

2.5 ERIC－PCR基因分型結(jié)果 59株菌株ERIC－PCR圖譜顯示電泳條帶集中分布在200～5 000bp，每株菌株都擴(kuò)出至少4個(gè)條帶。采用Quanlity One軟件進(jìn)行聚類分析，相似性聚類分析結(jié)果表明，59株菌株在80%的相似水平上被聚為52個(gè)類群。

3 討 論

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，隨著能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物金屬β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，對碳青霉烯類抗菌藥物及第3代頭孢菌素耐藥銅綠假單胞菌的分離率日漸增多，給臨床抗感染治療帶來極大的困難［5］。對碳青霉烯類耐藥主要與其產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶（如金屬酶）有關(guān)，而且這些耐藥基因常位于整合子和ISCR等耐藥元件的可變區(qū)基因盒中。整合子是一種運(yùn)動性的DNA分子，具有捕獲外源游離基因片段的功能，是細(xì)菌遺傳和變異的天然克隆和表達(dá)系統(tǒng)，臨床以I類常見［6］。ISCR1也是一種強(qiáng)大的耐藥基因捕獲元件，屬于IS1－like家族，通過滾環(huán)復(fù)制的方式轉(zhuǎn)作鄰近的耐藥基因，常位于普通整合子Ⅰ的3′末端［7］。

本院分離的59株碳青霉烯銅綠假單胞菌均為多重耐藥，研究發(fā)現(xiàn)整合子Ⅰ主要攜帶aacA4、aadA7和catB3，ISCR1主要攜帶qnrA1和ampR，復(fù)雜性整合子更是同時(shí)攜帶aacA4、catB3、qnrA1和ampR，提示整合子Ⅰ和ISCR1在銅綠假單胞菌介導(dǎo)多重耐藥方面有重要作用。59株菌株中5株攜帶金屬酶基因，攜帶率為8%，表明除了金屬酶的水解作用可以使銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物產(chǎn)生抵抗之外，還有其他機(jī)制參與，如膜孔蛋白的缺失、外排泵的過度表達(dá)等［8］；同時(shí)也提示本院銅綠假單胞菌已有金屬酶產(chǎn)生，這和碳青霉烯類抗菌藥物在本院廣泛應(yīng)用密切相關(guān)，應(yīng)引起臨床和控制感染部門的高度關(guān)注，應(yīng)杜絕不合理使用碳青霉烯類抗菌藥物的現(xiàn)象。

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌，醫(yī)院內(nèi)感染的原因主要是：（1）外源性交叉感染；（2）受自身免疫功能低下所致的內(nèi)源性感染。ERIC－PCR操作簡單、分型效率高、價(jià)格低廉，非常適合于研究醫(yī)院內(nèi)感染傳播機(jī)制［9］。本院臨床分離的59株菌株均能擴(kuò)增出條帶，分辨率高，圖譜聚類分析顯示80%的相似水平上被聚為52個(gè)類群，基因型分散，未顯示親密的親緣關(guān)系，不存在克隆傳播現(xiàn)象，由此表明59例耐碳青霉烯銅綠假單胞菌感染患者均為散發(fā)，不存在暴發(fā)或流行。

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