雞傳染性支氣管炎診斷方法研究進(jìn)展及應(yīng)用概況

粟 碩，張桂紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬中的IB病毒(IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病。該病首先由Schalk等于1931年在美國發(fā)現(xiàn)[1]，我國于1972年由鄺榮祿等首次在廣東報(bào)道；目前該病呈世界性流行，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一。目前已發(fā)現(xiàn)IBV近30種血清型，常見的有M 41、Conn、Iowa97等，我國流行的IBV類型主要為M型[2]。此外，新的血清型在不斷的出現(xiàn)，不同血清型的IBV之間僅有部分或完全沒有交叉免疫保護(hù)，不同血清型的臨床癥狀和病理變化存在差異，伴有混合感染、繼發(fā)感染等因素，給IB的免疫檢測和免疫預(yù)防帶來了很大困難。因此，為有效地控制IBV的流行，快速準(zhǔn)確的檢測方法區(qū)別不同IBV血清型致病毒株具有重要意義。

1 病原學(xué)診斷方法

1.1 病毒的分離鑒定 IBV的分離鑒定被認(rèn)為是檢測病原的金標(biāo)準(zhǔn)，因該方法比較耗時(shí)，而且所需材料成本較高，一般作為新方法建立的驗(yàn)證方法。常用氣管環(huán)培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒。氣管環(huán)培養(yǎng)時(shí)，采用18～20日齡雞胚，制備1mm厚氣管環(huán)做旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，3感染IBV 1d～4d，纖毛運(yùn)動(dòng)停止,繼而上皮細(xì)胞脫落。該方法可以作為IBV分離和滴定，并適用于不易在雞胚中增殖IBV分離株。在雞胚氣管組織培養(yǎng)中第1代即能夠很快產(chǎn)生纖毛止動(dòng)效應(yīng)，無需多次傳代培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒時(shí)，可用于IBV分離鑒定的細(xì)胞有Vero細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞(CTE)、雞胚腎細(xì)胞(CEK)等。2002年報(bào)道腎型 IBV在Marc145細(xì)胞獲得了適應(yīng)。孫裴等利用氣管灌注冷消化法分離培養(yǎng)出CTE，并報(bào)道腎型T株和呼吸型M 41株均能夠在CTE中獲得適應(yīng)培養(yǎng)，研究結(jié)果表明體外培養(yǎng)CTE可以放大或顯現(xiàn)出病毒在活體中不明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)[3]。

1.2 電鏡的病毒檢測 電鏡技術(shù)可以直觀、準(zhǔn)確的鑒別病毒，根據(jù)病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和大小等不同特征，可以做出診斷。將感染雞組織、器官或分泌物做常規(guī)負(fù)染色進(jìn)行電鏡觀察，IBV病毒粒子直徑90nm～200nm，囊膜表面具有許多間距較寬的杵狀突起,長約20nm，排列成冠狀。該方法直觀、快速，但該方法比較復(fù)雜，一般僅限于以研究為目的的應(yīng)用。

2 血清學(xué)診斷技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)血清學(xué)試驗(yàn)

2.1.1瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)自1966年Woernle將AGP標(biāo)準(zhǔn)化以來，該方法被廣泛應(yīng)用于IBV的抗體檢測，雞群中IBV抗體陽性率上升則表示存在IBV新近感染發(fā)生[4]。但該方法敏感性低，而且雞群中免疫IBV后的沉淀性抗體持續(xù)時(shí)間短；同時(shí)，抗原的制備處理是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一。封文海等認(rèn)為，用感染IBV的雞胚尿囊液和絨毛尿囊膜制備瓊擴(kuò)抗原，并以感染IBV后20h～30h的絨毛尿囊膜和感染IBV后48h～60h的尿囊液效果最佳[5]。該方法簡便快捷，特異性強(qiáng)，不受病毒亞型限制，但敏感性并未提高。

2.1.2血凝抑制試驗(yàn)(HI)該方法適用于IB的快速診斷，在臨床中可作為輔助性的檢測手段，具有簡便、快速的特點(diǎn)。但血凝抑制試驗(yàn)需要一系列方法處理抗原，并且HI滴度與保護(hù)力在免疫期并不相關(guān)。所以，該方法用于IBV診斷仍需深入研究。

2.1.3病毒中和試驗(yàn)(VNT)通常應(yīng)用已知病毒檢查待檢血清中的特異性抗體，該方法操作簡便，可在雞胚、雞胚腎細(xì)胞或氣管培養(yǎng)物中進(jìn)行。判定標(biāo)準(zhǔn)有觀察細(xì)胞病變、免疫熒光染色等多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)果往往帶有主觀因素。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA檢測法已被廣泛應(yīng)用IBV的檢測，ELISA在IB的早期感染、持續(xù)感染中均得到應(yīng)用，并可以同時(shí)用于特性抗原和抗體的檢測。在診斷方面，定期采血監(jiān)測正常雞群中IBV抗體的ELISA效價(jià)，當(dāng)雞群出現(xiàn)呼吸癥狀后，根據(jù)ELISA抗體升高的程度判斷是否存在感染IBV。母源抗體的存在對疫苗的免疫效果產(chǎn)生影響，常應(yīng)用ELISA檢測方法對疫苗免疫后血清中抗體的情況進(jìn)行調(diào)查。在敏感性方面，ELISA與HI試驗(yàn)反應(yīng)的曲線相似，但比較反應(yīng)值，ELISA的敏感性要高一些。Gibertoni等用酵母表達(dá)IBV的N蛋白作為ELISA包被抗原來檢測IBV抗體，取得了較好的效果[6]。

2.2.1間接ELISA該方法主要用于抗體IgM和IgG的檢測，Wang等利用原核表達(dá)的重組的IBV的N蛋白和部分S蛋白作為包被抗原建立了檢測IBV抗體的ELISA[7]。但以IBV重組表達(dá)蛋白作為診斷抗原尚處于探索階段，缺乏臨床應(yīng)用驗(yàn)證。磨美蘭等將ELISA、AGP及VNT 3種檢測IBV方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明ELISA的敏感性最高。ELISA的檢測敏感性為VNT的2.3倍，為AGP的188倍[8]。

2.2.2Dot-ELISA該方法是一種以硝酸纖維素膜等固相化基質(zhì)膜為載體的ELISA，用于檢測抗體或抗原，具有簡便、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果判定直觀等優(yōu)點(diǎn)，但也存在結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)的不足。劉紅等建立了應(yīng)用Dot-ELISA檢測IBV的方法，并對病毒的最低檢出量進(jìn)行了研究。不僅檢測純化的病毒，而且可直接用于檢測雞胚尿囊液或病變組織，可以作為IBV早期診斷的方法[9]。

2.2.3單克隆抗體(MAb)夾心ELISA該方法利用MAb包被ELISA板，具有極高的特異性。劉濱東等用MAb夾心ELISA檢測結(jié)果明顯高于傳統(tǒng)的雞胚氣管環(huán)法及雞胚傳代方法[10]。

2.2.4雙抗夾心ELISA該方法分別利用多克隆抗體、MAb作為一抗、二抗，并采用標(biāo)記抗鼠IgG的為指示系統(tǒng)，建立的ELISA檢測IBV的方法。該法比較適合于檢測病料和感染雞胚尿囊液中的IBV，但要求病料中病毒含量達(dá)到TOC半數(shù)感染量為10-5時(shí)方能夠檢出[11]。

2.3 免疫膠體金診斷技術(shù) 膠體金免疫層析法是將免疫膠體金技術(shù)與層析分析技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來建立的一種快速免疫學(xué)檢測技術(shù)。該技術(shù)最早用作電鏡的示蹤標(biāo)記物，并逐步應(yīng)用于禽病檢測，朱瑞良等用免疫膠體金試紙膜進(jìn)行快速檢測傳染性法氏囊病毒(IBDV)的研究，試驗(yàn)結(jié)果能夠識別不同的IBDV株[12]。王澤霖等采用膠體金標(biāo)記純化的羊抗鼠IgG，建立了一種對IBV進(jìn)行檢測的銀加強(qiáng)金標(biāo)免疫技術(shù)(SECGA)[13]。蘇磊等利用IBV MAb及兔抗IBV多抗建立了用于檢測IBV的免疫膠體金診斷試紙條技術(shù)，該技術(shù)通過與IBV雙抗夾心ELISA法比較，具有較高的特異性、靈敏性、穩(wěn)定性，并且可在加入待檢樣品15min后即可判定結(jié)果[14]。

3 病毒RNA診斷技術(shù)

3.1 RT-PCR PCR技術(shù)用于IB診斷使診斷技術(shù)提高到基因水平，該方法具有簡便快速和敏感性、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。Jackwood等提取了分屬于5個(gè)血清型的8株IBV的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用PCR擴(kuò)增，利用生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，結(jié)果這8株病毒均被檢出[15]。陸蘋等對四川分離的多株IBV S1基因和N基因用RT-PCR進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果證明RT-PCR檢測方法具有敏感性，特異性，適用于不同來源及不同血清型IBV的檢測[16]。潘盛通過在IBV非結(jié)構(gòu)基因3abc的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對引物，建立和優(yōu)化了一步法RT-PCR，并在此基礎(chǔ)上組裝成一步法RT-PCR檢測試劑盒。通過對8株IBV國內(nèi)分離株和3株國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株以及IB DNA疫苗(S1、M和N 3種基因混合)和4株雞常見病原體的檢測，表明該試劑盒具有極高的特異性[17]。王非等建立了雞傳染性喉氣管炎(IL)、IB、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT-PCR鑒別診斷方法，通過RT-PCR方法能檢測出極微量的病毒核酸，具有特異性強(qiáng)，敏感性高的特點(diǎn)，但由于弱毒疫苗株在宿主體內(nèi)的復(fù)制，有可能造成多重一出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對疫情的準(zhǔn)確判定造成影響[18]。

3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 實(shí)時(shí)定量PCR與普通PCR相比，其特異性和靈敏度都更高。崔沛首次在國內(nèi)建立了對IBV的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系，該方法有效提高了反應(yīng)特異性和靈敏度，更好地避免了假陰性結(jié)果，使PCR技術(shù)檢測痕量樣品的能力進(jìn)一步提高[19]。劉喬然等通過IBV tl/CH/LDT3/03株的N基因設(shè)計(jì)建立了檢測IBV核酸的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，其敏感性比常規(guī)PCR相比高 100倍[20]。Jackwood等根據(jù)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR中的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)設(shè)計(jì)多種特異性探針，根據(jù)各種探針的裂解曲線不同而進(jìn)行待檢病原的區(qū)分，建立了同時(shí)檢測9個(gè)IBV株的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)病毒株均能被很好的區(qū)分[15]。

3.3 DNA指紋圖譜分析 DNA指紋圖譜分析是80年代末期發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，根據(jù)檢測物在圖譜的產(chǎn)物位置上面存在差異，可以區(qū)別不同病毒株或者同一病毒株的變異株。Kusters等對12株分離自荷蘭的IBV進(jìn)行寡核苷酸指紋圖譜分析結(jié)果顯示，病毒株核苷酸序列的同源率均在95%以上。Butcher等利用該方法對DPI株10代及100代雞胚傳代物的T株、M 41株進(jìn)行了分析結(jié)果顯示，這4種圖譜均存在差異。該方法一般應(yīng)與其他方法相結(jié)合來進(jìn)行IBV的診斷。

3.4 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)。DNA芯片技術(shù)檢測疾病具有高通量、并行性和結(jié)果判讀客觀、準(zhǔn)確和信息化的特點(diǎn)。陳鳳梅通過分子克隆操作，獲得NDV、AIV、IBV、ILT、MG各一段特異性核苷酸序列，用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣，同時(shí)設(shè)系統(tǒng)監(jiān)控的參照基因，制備成“禽呼吸道疾病診斷基因芯片”。該方法敏感性高，重復(fù)性可以達(dá)90%～100%，但該檢測方法要求非常嚴(yán)格，易出現(xiàn)假陽性和假陰性[21]。曹三杰等年構(gòu)建制備了NDV、IBV、AIV和IBD等禽類主要疫病的基因檢測基因芯片，該方法具有同步檢測和鑒別診斷的功能[22]。

3.5 限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP) RFLP技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種最早的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)與RT-PCR結(jié)合，可針對IBV基因組的高度變異的特點(diǎn)，對其進(jìn)行快速診斷和分型。Lin等應(yīng)用該方法對IBV的S2基因分型方法與IBV的VN方法比較，兩方法很相符[23]。磨美蘭等用兩種引物結(jié)合的方法，對8個(gè)IBV分離株進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行RFLP分析，結(jié)果可以將其細(xì)分為7個(gè)基因型，更好地區(qū)分了不同的IB毒株[24]。Kwon等最早用RT-PCR技術(shù)獲取了含S1基因序列的11個(gè)病毒血清型的1700bp的序列，進(jìn)行了RFLP檢測，結(jié)果與用中和試驗(yàn)得出的病毒血清分型一致并對IBVS1基因進(jìn)行RT-PCR/RFLP分析已在血清學(xué)分類上得到了廣泛應(yīng)用[25]。Majdeni等在IBV的檢測中對比N基因和3'UTR的RT-PCR和RFLP方法對比S1基因的效果，結(jié)果表明前者在IBV不同血清型分類檢測中具有較高的敏感性[26]。

3.6 環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)RT-LAMP技術(shù)是建立在基礎(chǔ)PCR基礎(chǔ)上面的一種新型的核酸檢測的方法，具有簡便、快速高效、敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。陳豪泰等建立了檢測IBV的RT-LAMP檢測方法最小檢測病毒濃度為10ng[27]。Luo等通過對IBV高度保守的基因引物設(shè)計(jì)建立的RT-LAMP對IBV檢測的敏感性比RT-PCR高達(dá) 10倍[28]。

4 小結(jié)

目前IB病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)檢測方法的研究在廣度和深度上已有了較大進(jìn)展，但各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，每一種方法都難完全做到快速、簡便、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用。因此對IBV感染的診斷必須建立在臨床初步診斷的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷手段，快速確定病原，然后根據(jù)判定結(jié)果，制定相對應(yīng)的免疫程序，達(dá)到快速防治IBV感染的目的。

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