鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子及其潛在臨床轉(zhuǎn)化前景

梁 芳，曾朝陽(yáng)，李桂源

鼻咽癌是鼻咽部常見(jiàn)惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，80%的鼻咽癌發(fā)生在中國(guó)，因此被西方學(xué)者稱為“中國(guó)癌”。鼻咽癌由于其發(fā)病部位隱蔽，早期癥狀不明顯，容易被人忽視，常常延誤診斷;一經(jīng)發(fā)現(xiàn)往往已處于中晚期，耽誤最佳的治療時(shí)機(jī)，治療效果不佳。因此，尋找鼻咽癌早期診斷和預(yù)警的分子靶標(biāo)并開(kāi)發(fā)相應(yīng)的臨床診斷和預(yù)警試劑盒是鼻咽癌轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。

鼻咽部由于與外界直接相通，長(zhǎng)期受各種外來(lái)的化學(xué)物質(zhì)刺激，同時(shí)溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境適于各種微生物的生長(zhǎng)，是病原微生物(包括細(xì)菌、病毒等)侵入機(jī)體的重要門戶。鼻咽癌病因?qū)W研究表明，外來(lái)因素(特別是致癌微生物的刺激)導(dǎo)致的慢性炎癥是鼻咽癌發(fā)病的重要誘因，因此機(jī)體免疫系統(tǒng)在鼻咽癌早期的調(diào)控過(guò)程中起到了重要作用。

本課題組在國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃及多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助下，運(yùn)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)對(duì)不同分化階段、不同組織類型和不同臨床分期的鼻咽癌標(biāo)本進(jìn)行大規(guī)模篩選，發(fā)現(xiàn)鼻咽上皮分泌的固有免疫分子——腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate，lung and nasal epithelial clone，PLUNC)蛋白家族[1]和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(lactotransferrin，LTF)[2]是鼻咽上皮抵抗微生物感染第一道防線的重要組成部分，它們通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)也可作為鼻咽癌早期診斷與干預(yù)的重要分子靶點(diǎn)。

1 PLUNC蛋白家族

本課題組通過(guò)抑制性消減雜交聯(lián)合cDNA微陣列技術(shù)，克隆了鼻咽組織相對(duì)特異性表達(dá)基因SPLUNC1和LPLUNC1[3]。它們均屬于PLUNC 蛋白家族，是一種分泌性的蛋白質(zhì)，集中表達(dá)在鼻咽、口腔、鼻腔、呼吸道及消化道[1，4]。本課題組通過(guò)全基因組表達(dá)譜芯片及大樣本組織芯片證實(shí)在鼻咽部中度炎癥時(shí)鼻咽黏膜表面分泌物中PLUNC蛋白含量已經(jīng)顯著降低，在癌前病變中進(jìn)一步下降，在鼻咽癌早期PLUNC蛋白已經(jīng)檢測(cè)不到，因此PLUNC是一個(gè)非常靈敏和特異的鼻咽癌早期預(yù)警信號(hào)之一，可作為監(jiān)測(cè)鼻咽癌發(fā)生的分子標(biāo)記物[5-6]。針對(duì)該蛋白家族，本課題組已經(jīng)成功研發(fā)了鼻咽癌早期診斷試劑盒，并已經(jīng)獲得了國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)[7]。該試劑盒只需獲取受檢者少量的鼻咽部分泌物就可以檢測(cè)，無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛、檢測(cè)簡(jiǎn)便、成本較低，用于在健康體檢中進(jìn)行鼻咽癌高風(fēng)險(xiǎn)人群篩查具有極為廣闊的應(yīng)用前景;如能推廣應(yīng)用，可以達(dá)到鼻咽癌的極早期預(yù)測(cè)和判斷，大大提高鼻咽癌的早期檢出率;而鼻咽癌如果能早期發(fā)現(xiàn)，治療效果較好，患者預(yù)后比較理想。此外，本課題組在大量鼻咽癌病例中對(duì)放療后PLUNC蛋白水平與放療后患者生存率的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PLUNC蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌患者治療后預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)鼻咽癌患者放療后預(yù)后的可靠指標(biāo)之一。

PLUNC蛋白家族均包含殺菌滲透增強(qiáng)蛋白/脂多糖結(jié)合蛋白(bactericidal permeability-increasing protein/lipopolysaccharide-binding protein，BPI/LBP)結(jié)構(gòu)域，其中 LPLUNC1含有2個(gè) BPI結(jié)構(gòu)域，而SPLUNC1只含有1個(gè)BPI結(jié)構(gòu)域。本課題組已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PLUNC蛋白家族具有廣譜的殺滅細(xì)菌和病毒的能力，參與了機(jī)體固有免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程，對(duì)鼻咽部和上呼吸道黏膜抵抗外來(lái)細(xì)菌和病毒的侵襲具有非常重要的作用。重組PLUNC蛋白能與細(xì)菌脂多糖結(jié)合，殺滅或抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。對(duì)于鼻咽癌重要致瘤病毒——EB病毒，PLUNC蛋白能夠促進(jìn)EB病毒感染的細(xì)胞凋亡，抑制EB病毒致瘤蛋白 LMP1的表達(dá)，促進(jìn)EB病毒包膜糖蛋白gp350/220復(fù)合體表達(dá)，從而啟動(dòng)補(bǔ)體途徑對(duì)EB病毒進(jìn)行識(shí)別清除，或直接破壞EB病毒的完整性等途徑抑制EB病毒的致瘤作用[6]。

2 乳轉(zhuǎn)鐵蛋白

本課題組利用湖南鼻咽癌高發(fā)家系，通過(guò)連鎖分析，首次發(fā)現(xiàn)染色體3p21部分區(qū)域與湖南家族性鼻咽癌發(fā)病緊密連鎖[8]，單體型分析將湖南家族性鼻咽癌易感基因定位于該染色體區(qū)段中約13.6 cm范圍內(nèi)。隨后，通過(guò)基于家系的傳遞不平衡分析對(duì)上述連鎖分析結(jié)果進(jìn)行了確證[9]。發(fā)現(xiàn)染色體3p21這一新的鼻咽癌易感基因區(qū)后，利用基因芯片技術(shù)對(duì)位于該區(qū)域的所有基因在較大樣本鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織中進(jìn)行了較系統(tǒng)的表達(dá)譜分析，以篩選該染色體區(qū)域的鼻咽癌易感基因候選者，發(fā)現(xiàn)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(lactotransferrin，LTF)基因表達(dá)下調(diào)最為顯著[10-11]。隨后，我們自制的含976個(gè)組織點(diǎn)(包含正常鼻咽上皮、鼻咽癌及癌旁組織)的組織芯片[12]對(duì)以上篩選出的候選易感基因進(jìn)行大樣本免疫組化和原位雜交驗(yàn)證，證實(shí)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白為細(xì)胞分泌性蛋白，在鼻咽癌癌旁和鼻咽慢性炎癥組織中高表達(dá)，而在鼻咽癌組織中低表達(dá)或者不表達(dá)。

乳轉(zhuǎn)鐵蛋白又名乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，是一種非血紅素類的鐵結(jié)合糖蛋白，主要由黏膜上皮細(xì)胞和多形核淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，并分泌到乳汁、唾液、淚液、膽汁、胃腸液、氣管和鼻咽腔分泌物、生殖道分泌物和血漿中，其中以乳汁中的含量最高。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的生理功能廣泛，包括維持鐵穩(wěn)態(tài)、預(yù)防病原微生物感染和抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)等，是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)中的重要天然免疫分子之一。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)下調(diào)與其血清中EB病毒殼抗原IgA(virus capsid antigen-IgA，VCA-IgA)抗體滴度呈負(fù)相關(guān)[13]，推測(cè)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)增加了EB病毒感染的概率。進(jìn)一步通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)LTF能與B細(xì)胞上的EB病毒受體CD21分子結(jié)合，阻斷B細(xì)胞上的EB病毒結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止EB病毒吸附并進(jìn)入B細(xì)胞。同時(shí)，利用B細(xì)胞與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)LTF確實(shí)可抑制EB病毒由B細(xì)胞向上皮細(xì)胞的傳遞[14]。此外，LTF還能夠降低Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)對(duì)EB病毒DNA的識(shí)別能力，抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路的激活，減輕EB病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)LTF可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，將細(xì)胞周期阻滯于G0～G1期，能負(fù)調(diào)控絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的c-jun氨基末端激酶2(c-jun N-teuninal kinase 2，JNK2)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，下調(diào) cyclin D1和phos-RB，上調(diào)p21、p27。這說(shuō)明LTF通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖[10]。研究還發(fā)現(xiàn)LTF可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。過(guò)表達(dá)LTF的鼻咽癌細(xì)胞系的侵襲與轉(zhuǎn)移能力明顯下降，接種裸鼠之后成瘤能力亦明顯下降，并且肺轉(zhuǎn)移灶明顯減少。其分子機(jī)制主要是因?yàn)長(zhǎng)TF能夠抑制3'-磷酸肌醇依賴性激酶(3'-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)，進(jìn)而抑制AKT的磷酸化水平，另外LTF可抑制AKT的膜轉(zhuǎn)位。PDK1/AKT通路對(duì)腫瘤增殖以及轉(zhuǎn)移均有非常重要的影響。大樣本的臨床驗(yàn)證亦發(fā)現(xiàn)LTF與鼻咽癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，具有很好的預(yù)后判斷的價(jià)值[15]。綜上所述，LTF不僅是鼻咽癌重要的天然免疫分子，還可作為鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展預(yù)測(cè)的分子靶標(biāo)。

3 鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子在臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用前景

目前對(duì)鼻咽癌早期的檢驗(yàn)方法主要是EB病毒血清學(xué)標(biāo)記物如VCA-IgA、EB病毒早期抗原(early antigen IgG，EA-IgG)的抗體檢測(cè)，雖然這些指標(biāo)的單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用為鼻咽癌的診斷提供了有用的信息，但它們均缺乏足夠的靈敏度與特異性，仍然只能作為一種相關(guān)指標(biāo)起提示作用，不能用來(lái)作為鼻咽癌的確診指標(biāo)。即使是病理性的診斷，也難以一次性取到病變組織，無(wú)法避免對(duì)微小病灶的多次有創(chuàng)性取樣。鼻咽癌非典型病灶型或黏膜下型的病例雖經(jīng)多次活檢，常因無(wú)病理切片陽(yáng)性結(jié)果而延誤治療。對(duì)于放療后的病例，當(dāng)其鼻炎組織表現(xiàn)不典型時(shí)，在判斷其病變是復(fù)發(fā)還是放療反應(yīng)上，也左右為難;尤其是某些放療后出現(xiàn)顱腦癥狀的患者，各項(xiàng)檢查(包括病理檢查)都很難準(zhǔn)確判斷到底是放射性腦病還是癌灶向顱內(nèi)發(fā)展，極大影響治療策略。綜上所述，建立一種能對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行篩查、診斷的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)方法，對(duì)鼻咽癌的早期篩查、診斷、預(yù)防及治療等具有重要意義。

惡性腫瘤的防治在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子作用開(kāi)始于鼻咽癌的早期階段，并影響疾病的發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程，是一類潛在的臨床篩查標(biāo)記、治療靶標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)。

PLUNC蛋白家族是正常人體呼吸道黏膜表面天然存在的蛋白質(zhì)，對(duì)人體完全無(wú)害，可以研發(fā)相關(guān)噴鼻劑、外傷敷料等，發(fā)揮其抗微生物、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的功效。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在人乳汁中含量豐富，對(duì)嬰幼兒的免疫保護(hù)作用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值已得到廣泛認(rèn)可，也被廣泛應(yīng)用到乳制品和其他保健品中。本課題組研究發(fā)現(xiàn)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白可直接抵抗EB病毒入侵宿主細(xì)胞，并通過(guò)抗炎作用抑制微生物感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受過(guò)度的炎癥反應(yīng)所帶來(lái)的損傷。提示可以將乳鐵蛋白作為預(yù)防性藥物或營(yíng)養(yǎng)品應(yīng)用于EB病毒感染相關(guān)的疾病患者如鼻咽癌患者或其易感人群，為乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在鼻咽癌等EB病毒相關(guān)疾病預(yù)防和干預(yù)中的應(yīng)用提供新的證據(jù)。同時(shí)，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白能抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的功能使得這種人乳中的天然成分在腫瘤的治療中也顯現(xiàn)出重要的臨床價(jià)值，有望成為臨床治療的分子靶標(biāo)。相信這些鼻咽癌相關(guān)固有免疫分子將具有極大的臨床潛在轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值。

[1]周后德，李小玲，李桂源.新的天然免疫保護(hù)分子——PLUNC家族蛋白[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2004，31(9):767-771.

[2]黃宏斌，鄧敏，鄭瑛，等.天然免疫分子乳鐵蛋白抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2013[in press，http://www.pibb.ac.cn/cn/ch/common/create_pdf.aspx?file_no=20120540＆flag=1].

[3]Zhang B，Nie X，Xiao B，et al.Identification of tissue-specific genes in nasopharyngeal epithelial tissue and differentially expressed genes in nasopharyngeal carcinoma by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray[J].Genes Chromosomes Cancer，2003，38(1):80-90.

[4]郭小芳，陳攀，李夏雨，等.新的天然免疫保護(hù)分子SPLUNC1的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2012，39(10):945-951.

[5]Zhou HD，F(xiàn)an SQ，Zhao J，et a1.Tissue distribution of the secretory protein，SPLUNC1，in the human fetus[J].Histochem Cell Biol，2006，125(3):315-324.

[6]Zhou HD，Li XL，Li GY，et al.Effect of SPLUNC1 protein on the Pseudomonas aeruginosa and Epstein-Barr virus[J].Mol Cell Biochem，2008，309(1/2):191-197.

[7]李桂源，周后德，周鳴，等.鼻咽組織特異性基因編碼蛋白的檢測(cè)試劑盒、制備及其應(yīng)用:中國(guó)，10047032.3[P/OL].2005-06-08[2013-01-05].http://211.157.104.87:8080/sipo/zljs/hyjs-yx-new.jsp?recid=CN200410047032.3.

[8]Xiong W，Zeng ZY，Xia JH，et al.A susceptibility locus at chromosome 3p21 linked to familial nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Res，2004，64(6):1972-1974.

[9]Zeng Z，Zhou Y，Zhang W，et al.Family-based association analysis validates chromosome 3p21 as a putative nasopharyngeal carcinoma susceptibility locus[J].Genet Med，2006，8(3):156-160.

[10]Zhou Y，Zeng Z，Zhang W，et al.Lactotransferrin:a candidate tumor suppressor-Deficient expression in human nasopharyngeal carcinoma and inhibition of NPC cell proliferation by modulating the mitogen-activated protein kinase pathway[J].Int J Cancer，2008，123(9):2065-2072.

[11]Zhou Y，Zeng Z，Zhang W，et al.Identification of candidate molecular markers of nasophary-ngeal carcinoma by microarray analysis of subtracted cDNA libraries constructed by suppression subtractive hybridization[J].Eur J Cancer Prev，2008，17(6):561-571.

[12]李桂源，范松青，馬健，等.一種用于腫瘤早期診斷的組織芯片及制備器具:中國(guó)，10022818.X[P/OL].2004-12-22[2013-01-05].http://211.157.104.87:8080/sipo/zljs/hyjs-yx-new.jsp?recid=CN200410022818.X.

[13]Zhang W，Zeng Z，Zhou Y，et al.Identification of aberrant cell cycle regulation in Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma by cDNA microarray and gene set enrichment analysis[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2009，41(5):414-428.

[14]Zheng Y，Zhang W，Ye Q，et al.Inhibition of Epstein-Barr virus infection by lactoferrin[J].J Innate Immun，2012，4(4):387-398.

[15]Deng M，Zhang W，Tang H，et al.Lactotransferrin acts as a tumor suppressor in nasopharyngeal carcinoma by repressing AKT through multiple mechanisms[J].Oncogene，2012[Epub ahead of print].