抗肝癌治療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

唐 旭，胡志芳，郭 娜，茍興春

眾所周知，臨床一些惡性腫瘤在自身進(jìn)展過程中及治療后，其惡性程度不斷增加，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖、周期縮短、生長速度加快、局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，并因此最終導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散及患者的死亡。目前越來越多的的研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與上述現(xiàn)象密切相關(guān)，針對上述現(xiàn)象學(xué)術(shù)界也提出了腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell)學(xué)說。EMT表現(xiàn)為上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞在自身進(jìn)展過程中及治療后，逐漸失去上皮細(xì)胞的特征，取而代之出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特征，腫瘤細(xì)胞的惡性程度相應(yīng)增強(qiáng)。而腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，腫瘤的自身進(jìn)展以及治療的過程對腫瘤細(xì)胞本身而言也是生存選擇的過程，部分腫瘤細(xì)胞被淘汰死亡后最終能夠存活的細(xì)胞屬于腫瘤干細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞的惡性程度明顯高于腫瘤早期構(gòu)成非常復(fù)雜的腫瘤細(xì)胞群。雖然EMT與腫瘤干細(xì)胞學(xué)說[1-2]都能在一定程度上解釋上述臨床現(xiàn)象，但均有待進(jìn)一步修正和完善;而兩者之間的關(guān)系也很復(fù)雜，相互之間可能屬于包含關(guān)系、交叉重疊關(guān)系，或者是相互誘導(dǎo)關(guān)系。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是一種臨床常見、預(yù)后極差的惡性腫瘤。盡管多種療法在臨床得以開展并取得了巨大進(jìn)展，但總體療效仍難以令人滿意。臨床觀察發(fā)現(xiàn)除外科手術(shù)切除和肝移植等被認(rèn)為是可根治肝癌的主要手段之外，其他多種治療手段在發(fā)揮治療作用的同時(shí)，卻能夠促進(jìn)肝癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。這種治療本身的“反面效應(yīng)”極大地限制了抗肝癌治療的最終療效，是臨床抗肝癌治療亟待解決的一個(gè)難題。目前治療本身誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT在上述“反面效應(yīng)”中的作用已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界研究的一個(gè)焦點(diǎn)，針對治療誘導(dǎo)EMT的研究可能闡明臨床各種治療手段本身促進(jìn)肝癌惡性進(jìn)展的機(jī)制。本文綜述近年來該領(lǐng)域的研究進(jìn)展，為臨床改善肝癌治療效果提供依據(jù)。

1 EMT的概念及特征

EMT是指極化、靜止的上皮細(xì)胞在特定的情況下向具有運(yùn)動能力的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的復(fù)雜現(xiàn)象，在此過程中上皮細(xì)胞的極性消失，而遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)。作為一種高度保守的細(xì)胞現(xiàn)象，EMT涉及到胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及腫瘤發(fā)生等多種生理和病理過程。由于EMT能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞-細(xì)胞之間、細(xì)胞-基質(zhì)之間的連接，離開其生存微環(huán)境并經(jīng)血道和淋巴道侵入其他器官，因此被認(rèn)為是腫瘤局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的非常重要的起始環(huán)節(jié)[3]。由于臨床觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)惡性腫瘤患者均死于腫瘤轉(zhuǎn)移[4]，而EMT被認(rèn)為是上皮來源的惡性腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因，因此EMT在腫瘤進(jìn)展特別是轉(zhuǎn)移中的作用已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。

腫瘤細(xì)胞EMT的功能意義十分復(fù)雜，目前比較一致的看法認(rèn)為EMT是腫瘤細(xì)胞自身在局部增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移兩個(gè)發(fā)展方向之間的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)[5]。EMT不僅能促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，還能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞化[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，EMT和肝癌細(xì)胞化療抵抗也具有密切的關(guān)系[7-8]。

EMT的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Twist、Snail和ZEB1等多種轉(zhuǎn)錄因子以及E-cadherin、β-catenin、fibronectin和 vimentin 等多種下游轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)分子[3]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌癌周組織高表達(dá)的 ZEB2[9]、肝癌組織高表達(dá)的 p300[10]、CD147[11]以及Twist1[12]等分子均和肝癌細(xì)胞EMT具有十分密切的聯(lián)系。

2 化療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT

化療是臨床最重要的抗肝癌治療手段之一。盡管近年來研發(fā)的以索拉非尼(sorafenib)為代表的抗腫瘤血管生成靶向藥物兼具抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抗腫瘤血管生成的雙重抗癌機(jī)制，且與傳統(tǒng)化療藥物相比其治療肝癌的優(yōu)越性已被臨床觀察初步證實(shí)[13]，但以鉑類(platinum)、多柔比星(adriamycin)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)等細(xì)胞毒性藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，仍然是目前臨床肝癌化療最常使用的化療方案。據(jù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞毒性藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療有效率僅為20%左右，且對患者存活率沒有明顯改善[14]，因此近年來化療對肝癌細(xì)胞的“反面效應(yīng)”研究已經(jīng)開始獲得關(guān)注。研究人員[15]使用奧沙利鉑(oxaliplatin)模擬臨床給藥特點(diǎn)脈沖式處理體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2和MHCC97L后，殘留的肝癌細(xì)胞增殖被抑制，而運(yùn)動能力、侵襲能力卻明顯增強(qiáng);形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)殘留的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞特征，同時(shí)分子生物學(xué)檢測進(jìn)一步證實(shí)殘留肝癌細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-鈣黏附素(E-cadherin)蛋白表達(dá)下調(diào)，相反間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)，已知對EMT具有誘導(dǎo)作用的轉(zhuǎn)錄因子Snail在殘留肝癌細(xì)胞中表達(dá)也明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果提示，奧沙利鉑能體外誘導(dǎo)殘留肝癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT，而且可能和轉(zhuǎn)錄因子Snail的激活有關(guān)。在后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，研究人員將MHCC97L細(xì)胞種植于裸鼠肝臟，經(jīng)奧沙利鉑或0.9%氯化鈉腹膜內(nèi)注射預(yù)處理后，再次接種于其他裸鼠肝臟進(jìn)行觀察，結(jié)果數(shù)周后雖然奧沙利鉑預(yù)處理組肝癌瘤體體積及細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯低于0.9%氯化鈉預(yù)處理組，但是奧沙利鉑預(yù)處理組裸鼠肝癌的肺轉(zhuǎn)移率為83%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0.9%氯化鈉預(yù)處理25%的肺轉(zhuǎn)移率;針對瘤體組織的分子生物學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志分子、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子和轉(zhuǎn)錄因子Snail的變化與體外實(shí)驗(yàn)一致。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)化療藥物能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。

3 放射治療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT

放射療法用于肝癌的治療已有半個(gè)世紀(jì)，近年來隨著適形放療技術(shù)的出現(xiàn)以及放射生物學(xué)觀念的更新，放療在肝癌治療中的地位有所提高[16]。數(shù)十年前臨床觀察就發(fā)現(xiàn)放射治療本身能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制一直不明[17]。最近科研人員首次研究了放療后殘留肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的變化，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人肝癌MHCC97L細(xì)胞在經(jīng)放射線處理后的4 d內(nèi)，其侵襲能力增強(qiáng)，且增強(qiáng)程度與放射線劑量及放射線作用時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系[18]。為在體內(nèi)驗(yàn)證放療結(jié)束后殘留肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化，研究人員進(jìn)一步將MHCC97L細(xì)胞接種于裸鼠肝臟建立裸鼠人肝癌原位模型，放療組進(jìn)行放療處理，對照組不進(jìn)行放療處理;放療結(jié)束后2 d或30 d切除殘留肝癌組織和對照組肝癌組織，按同等體積再次種植于正常裸鼠肝臟，再種植6周后進(jìn)行觀察和檢測。結(jié)果與再種植對照組肝癌組織相比:放療結(jié)束后2 d切除殘癌再種植肝癌的生長及肺轉(zhuǎn)移均受到抑制，然而放療結(jié)束后30 d切除殘癌再種植肝癌的生長速度卻得到恢復(fù)，并且肺轉(zhuǎn)移也顯著增加;相應(yīng)地，放療結(jié)束后30 d切除殘癌再種植肝癌在裸鼠肝內(nèi)呈播散性生長，而再種植對照組肝癌未見肝內(nèi)播散。上述結(jié)果提示，放療結(jié)束后殘留肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長及侵襲、轉(zhuǎn)移能力先減弱后增強(qiáng)。后續(xù)的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，放療誘導(dǎo)的殘留肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)主要是通過放療上調(diào)殘留肝癌細(xì)胞跨膜絲氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serine 4，TMPRSS4)表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)殘留肝癌細(xì)胞EMT實(shí)現(xiàn)的。放療結(jié)束后30 d切除殘癌再種植肝癌細(xì)胞具有明顯的間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)特征。因此，肝癌細(xì)胞EMT在肝癌放療中的功能意義值得進(jìn)一步深入研究。

4 肝動脈化療栓塞誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT

肝臟本身具有獨(dú)特的肝動脈和門靜脈雙重供血結(jié)構(gòu)，在這一解剖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上派生的經(jīng)肝動脈化療栓塞(transarterial chemoembolization，TACE)具有重要的臨床價(jià)值。目前，TACE不僅是不切除肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[19]，也作為其他肝癌治療方法的輔助手段用于肝癌的綜合治療，如用于肝移植或瘤體手術(shù)切除前縮小瘤體體積;隨著相關(guān)技術(shù)的改進(jìn)，TACE在早期和中期肝癌臨床治療中的應(yīng)用范圍也在不斷拓展。然而，臨床觀察發(fā)現(xiàn)TACE雖然能縮小肝癌原發(fā)灶體積，但TACE之后肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移特別是肺轉(zhuǎn)移的概率卻明顯增加[20]。闡明TACE促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前提高TACE療效的迫切需要。

已知TACE誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的機(jī)制有3個(gè)方面，即化療藥物、缺氧及營養(yǎng)物質(zhì)斷絕引起的饑餓?；熣T導(dǎo)的EMT如前所述，最近的研究發(fā)現(xiàn)缺氧及營養(yǎng)物質(zhì)斷絕引起的饑餓也具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的作用。缺氧雖然能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，但其本身作為一種選擇因素卻能同時(shí)刺激腫瘤細(xì)胞通過EMT及其他機(jī)制增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞離開不利的缺氧環(huán)境發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并繼續(xù)生存，因此缺氧也是促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展的最關(guān)鍵因素之一[21]。已知腫瘤細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)在缺氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮著中樞性作用。最新的研究[7]發(fā)現(xiàn)，缺氧能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT，并伴有遷移和侵襲能力增強(qiáng)。機(jī)制研究提示，缺氧誘導(dǎo)的EMT和磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3 kinase)/蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine，Akt)/HIF-1α 信號通路激活有關(guān);針對肝癌裸鼠移植模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)抑制PI3K/Akt的活性和HIF-1α的功能能夠增強(qiáng)缺氧的抗肝癌效果。肝癌細(xì)胞高表達(dá)的p28GANK可能是該信號通路的上游分子，能夠活化該信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT以及侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。CD147是一種高表達(dá)于肝癌組織并與肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)的癌相關(guān)蛋白[23]，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路能通過轉(zhuǎn)錄因子Slug直接調(diào)節(jié)CD147基因促進(jìn)CD147蛋白表達(dá)，CD147蛋白進(jìn)一步促進(jìn)肝癌EMT的發(fā)生[11];而缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α和特異蛋白1(specificity protein 1，Sp1)能夠通過協(xié)同效應(yīng)激活CD147啟動子上調(diào)CD147蛋白表達(dá)，缺氧狀態(tài)下上調(diào)的CD147蛋白表達(dá)使肝癌細(xì)胞侵襲能力進(jìn)一步增強(qiáng)[24]。上述研究表明，CD147可能在TACE誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮重要作用，而且其表達(dá)受到多種調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)控。

眾所周知，腫瘤細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下遷移和侵襲等運(yùn)動能力增強(qiáng)，因此饑餓能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制尚不明確。筆者先前的預(yù)實(shí)驗(yàn)用尼爾平衡鹽溶液(Earle's balanced salt solution，EBSS)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞模擬肝癌細(xì)胞饑餓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMMC7721、HepG2和HCC9204肝癌細(xì)胞的CD147蛋白表達(dá)明顯增高，提示饑餓也可能通過誘導(dǎo)CD147表達(dá)參與TACE時(shí)肝癌細(xì)胞的EMT，但需要進(jìn)一步證實(shí)。

當(dāng)前以索拉非尼為代表的抗腫瘤血管生成靶向藥物已經(jīng)成為臨床肝癌化療的主要方向，通過抑制腫瘤血管生成導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺氧和饑餓性死亡是這類藥物最重要的抗腫瘤機(jī)制。臨床觀察發(fā)現(xiàn)這類藥物在有效發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，也能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[25]，但上述現(xiàn)象與EMT之間的關(guān)系目前缺乏研究。

5 EMT的干預(yù)

盡管治療誘導(dǎo)EMT的具體機(jī)制尚不明確，但目前的基礎(chǔ)研究已經(jīng)證實(shí)，抑制治療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生，能在一定程度上增強(qiáng)原始治療手段的療效，并抑制殘留肝癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。例如具有抗癌功能的復(fù)方中藥制劑“松有飲”能逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT，并增強(qiáng)奧沙利鉑的抗肝癌效果[15];三肽酪絲亮肽(tyroserleutide)能通過下調(diào)HIF-1α和TMPRSS4抑制EMT的發(fā)生從而抑制放射誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[26];直接或間接抑制PI3 kinase/Akt/HIF-1α信號通路能夠逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT，并抑制增強(qiáng)的肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[7，22]。上述結(jié)果提示，在未來的臨床抗肝癌治療中，EMT可能是一個(gè)重要的干預(yù)靶點(diǎn)，抑制治療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT對于原始抗肝癌治療手段可能具有重要的協(xié)同治療價(jià)值。

眾多的臨床觀察和基礎(chǔ)研究已經(jīng)表明，治療手段本身誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT是肝癌治療失敗并導(dǎo)致肝癌轉(zhuǎn)移和患者死亡的重要原因之一。已有學(xué)者注意到腫瘤細(xì)胞增殖抑制與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)之間具有十分密切的內(nèi)在聯(lián)系，并推測快速增殖對原發(fā)腫瘤的發(fā)生和維持非常關(guān)鍵;相反抗腫瘤增殖治療或某些腫瘤生長抑制基因的激活，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)，可能引發(fā)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)EMT并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和存活，并由此導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性表型的發(fā)展[27]。因此，EMT必將是肝癌治療時(shí)需要考慮的一個(gè)輔助治療靶點(diǎn)，抑制或阻斷治療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生必將是臨床未來抗肝癌綜合治療的重要組成部分。

雖然目前學(xué)術(shù)界對于治療誘導(dǎo)EMT的研究尚處于初級階段，但可以肯定的是，鑒定參與治療誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生的關(guān)鍵分子并闡明其相應(yīng)的信號通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括不同抗肝癌治療手段誘導(dǎo)EMT的機(jī)制之間的相互關(guān)系，對于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)分子、開發(fā)新的靶向治療手段和藥物，最終通過采用聯(lián)合、協(xié)同治療方案提高各種抗肝癌療法的療效，具有非常重要的理論意義和臨床價(jià)值。同時(shí)，治療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT與腫瘤干細(xì)胞之間的相互關(guān)系也值得深入研究。

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