創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠模型的建立及其有效性探討

晉 翔，王 文，王化寧，譚慶榮，鄭 紅

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post trauma stress disorder，PTSD)是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)，臨床表現(xiàn)包括反復(fù)重現(xiàn)創(chuàng)傷性體驗(yàn)、情感麻木、回避、警覺(jué)過(guò)強(qiáng)所致持續(xù)性焦慮、驚恐逃避以及易激惹癥狀等癥候群[1]。多數(shù)研究認(rèn)為應(yīng)激強(qiáng)度與PTSD的發(fā)病率存在“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，應(yīng)激強(qiáng)度越高患病的可能性越大[2]。由于缺少合適的動(dòng)物模型使PTSD的研究受到很大的限制，因此對(duì)其神經(jīng)生物學(xué)致病機(jī)制研究及臨床治療帶來(lái)很大的困難。單次延長(zhǎng)應(yīng)激(single prolonged stress，SPS)動(dòng)物模型由心理應(yīng)激(束縛應(yīng)激)和生理應(yīng)激(強(qiáng)迫游泳、乙醚麻醉)構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)采用SPS的方法建立PTSD大鼠模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠24只，第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量(200±20)g，光亮/黑暗周期為12 h/12 h，光照時(shí)間7:00—19:00，環(huán)境溫度為22～24℃，相對(duì)濕度60%，正常攝食攝水，飼養(yǎng)1周開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作和處理按照《第四軍醫(yī)大學(xué)關(guān)于利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開展研究的規(guī)定》執(zhí)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及器材 乙醚(分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)，松下微型攝像機(jī)(HDCSD10，日本)，Morris 水迷宮(Morris water maze，MWM)視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)，自制束縛器、游泳缸。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control組，n=12)、單次延長(zhǎng)應(yīng)激組(SPS組，n=12)，分組當(dāng)天完成模型組單次延長(zhǎng)應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)流程 SPS組和control組大鼠不受打擾飼養(yǎng)15 d，第16天行曠場(chǎng)(open-field，OF)和高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)實(shí)驗(yàn);第16天起行連續(xù)6 d的MWM實(shí)驗(yàn)，其中5 d為空間學(xué)習(xí)能力測(cè)試，最后1 d為記憶能力測(cè)試。

1.2.2 應(yīng)激方法 首先將大鼠置于束縛器束縛2 h，隨后將其放入23～25℃水溫的游泳缸(直徑24 cm，高50 cm)強(qiáng)迫游泳20 min;游泳缸側(cè)面置一數(shù)碼攝像頭，動(dòng)態(tài)記錄大鼠在強(qiáng)迫游泳裝置中游泳的錄像資料;設(shè)定分析參數(shù)，進(jìn)行在線或離線數(shù)據(jù)分析。休息15 min后乙醚麻醉失去知覺(jué)。麻醉后將大鼠置于通風(fēng)處至自然蘇醒，后放回飼養(yǎng)籠不受打擾飼養(yǎng)15 d。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 利用EPM、OF實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物的高警覺(jué)性、焦慮/抑郁、恐懼行為

(1)EPM 實(shí)驗(yàn):參照 Cohen等[3]的方法，利用不透明有機(jī)玻璃制成0.5 m高的高架十字迷宮，中間為8 cm×8 cm的平臺(tái)。將大鼠放于EPM的中央平臺(tái)上，鼠頭統(tǒng)一朝向同一方向，10 s適應(yīng)后，記錄其行動(dòng)5 min，記錄大鼠在開臂停留時(shí)間以及大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)等行為學(xué)指標(biāo)。然后采用高架十字迷宮視頻分析系統(tǒng)分析動(dòng)物的各項(xiàng)行為指標(biāo)。

(2)OF實(shí)驗(yàn):參照 kalynchuk等[4]的方法，在直徑47 cm×47 cm的黑暗曠場(chǎng)上用攝像頭監(jiān)視大鼠的活動(dòng)情況，采集視頻后分析各項(xiàng)行為指標(biāo)。具體方法:將大鼠放于曠場(chǎng)行為觀察箱中，10 s適應(yīng)后，開始記錄大鼠行為15 min，分析大鼠的活動(dòng)次數(shù)、水平運(yùn)動(dòng)距離。

1.2.3.2 利用MWM實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶能力MWM為一直徑120 cm、高55 cm的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，池內(nèi)水深42 cm，水溫保持在(22±2)℃，房間內(nèi)光照恒定，無(wú)光線直射在水池內(nèi)。池壁上以4個(gè)等距離點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限，在靶象限(設(shè)為第一象限)內(nèi)距離池壁35 cm處放有一個(gè)直徑為8 cm、高40 cm的圓形黑色站臺(tái)，站臺(tái)位于水面下2 cm。池壁內(nèi)貼有不同形狀及顏色的標(biāo)記物。迷宮上方安置連接攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。采用MWM視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行信息處理，提供大鼠上臺(tái)潛伏期、靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比、穿臺(tái)次數(shù)等多個(gè)指標(biāo)。

(1)定位航行實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前任意選定一個(gè)目標(biāo)象限將大鼠置于站臺(tái)上適應(yīng)20 s，隨后將大鼠隨機(jī)從不同位置(靶象限除外)面壁置入池內(nèi)。大鼠登上站臺(tái)5 s后終止記錄，最長(zhǎng)記錄時(shí)間為60 s，若大鼠在60 s內(nèi)不能上臺(tái)，引導(dǎo)其登上站臺(tái)適應(yīng)10 s，最后將大鼠擦干放入鼠籠。如此將大鼠置入游泳池4次。測(cè)量平均上臺(tái)潛伏期，以評(píng)判大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。在第1～5天分別重復(fù)上述步驟。

(2)空間探索實(shí)驗(yàn):在第6天撤掉水面下的站臺(tái)，然后將大鼠面壁置入池內(nèi)1次，記錄大鼠在60 s內(nèi)游泳軌跡并進(jìn)行分析，最后將大鼠擦干放入鼠籠。記錄穿臺(tái)次數(shù)并計(jì)算大鼠在靶象限活動(dòng)時(shí)間的百分比，評(píng)判大鼠的空間記憶能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組動(dòng)物之間的均數(shù)采用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPS應(yīng)激后對(duì)大鼠EPM行為的影響 SPS組開臂進(jìn)入次數(shù)的百分比(23.55±3.79)%和開臂停留時(shí)間百分比(11.45±2.77)%顯著低于control組[(37.83±4.07)%，(17.85±3.45)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。提示單次延長(zhǎng)應(yīng)激有明顯的長(zhǎng)時(shí)間致焦慮效應(yīng)。

2.2 SPS應(yīng)激后對(duì)大鼠OF行為的影響 應(yīng)激15 d后，兩組大鼠5 min內(nèi)水平活動(dòng)距離、中央停留時(shí)間存在差異(P＜0.05)，SPS組大鼠的水平活動(dòng)距離[(4 557.35)mm、中央停留時(shí)間(37.12±4.10)s]均較 control組[(8 775.85)mm，(22.65±1.54)s]明顯減少(表1)。提示單次延長(zhǎng)應(yīng)激導(dǎo)致大鼠活動(dòng)性和探索性抑制，警覺(jué)水平、焦慮狀態(tài)增強(qiáng)。

2.3 SPS應(yīng)激后對(duì)大鼠MWM空間學(xué)習(xí)能力及空間記憶能力的影響

2.3.1 SPS應(yīng)激后對(duì)大鼠MWM空間學(xué)習(xí)能力的影響 SPS組與control組第1～5天隨著時(shí)間的延長(zhǎng)上臺(tái)潛伏期逐漸縮短。SPS組第1～5天的上臺(tái)潛伏期分別為(49.27±2.78)、(33.04±3.85)、(29.18±3.51)、(20.98±2.76)、(19.67±2.66)次;control組第1～5天的上臺(tái)潛伏期分別為(44.6±5.46)、(25.59±4.76)、(13.21±2.68)、(10.23±1.08)、(9.63±0.94)次。SPS組與control組相比第3～5天上臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)，提示其學(xué)習(xí)和記憶的獲得與鞏固過(guò)程受到顯著影響。

圖1 SPS應(yīng)激后對(duì)大鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)能力的影響

2.3.2 SPS應(yīng)激后對(duì)大鼠MWM空間記憶能力的影響 SPS組在Morris水迷宮4個(gè)象限無(wú)目的漫游，在靶象限花費(fèi)時(shí)間的百分比(32.15±2.82)%和穿臺(tái)次數(shù)(1.15±0.26)次與control組靶象限花費(fèi)時(shí)間的百分比(51.68±4.38)%和穿臺(tái)次數(shù)(2.87±0.35)次相比均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。提示單次延長(zhǎng)應(yīng)激記憶的讀出或提取受到顯著損害。

表1 大鼠EPM、OF、空間探索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

3 討論

PTSD是一組與應(yīng)激密切相關(guān)的精神疾病，突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性生活事件是引發(fā)PTSD的首要因素。無(wú)論是人類或其他生物在面臨不適于其生存的重大應(yīng)激時(shí)，必然產(chǎn)生緊張、焦慮、恐懼、抑郁的情緒反應(yīng)。但目前無(wú)理想的動(dòng)物模型復(fù)制PTSD用以機(jī)制及藥物干預(yù)研究，因此建立標(biāo)準(zhǔn)的PTSD的動(dòng)物模型有重要的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用價(jià)值。

EPM實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究性，以及對(duì)高懸開臂的恐懼感而形成矛盾沖突狀態(tài)來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮素質(zhì)特征[5]。SPS大鼠在EPM實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為開臂進(jìn)入次數(shù)的百分比和開臂停留時(shí)間百分比較空白對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。說(shuō)明受到單次延長(zhǎng)應(yīng)激后的大鼠被置于EPM的中央?yún)^(qū)時(shí)，探究、好奇的天性減弱，與外界相通的開臂對(duì)其帶來(lái)的威脅性增強(qiáng)，焦慮、恐懼水平明顯增高，大鼠很快從中央?yún)^(qū)逃跑，離開開臂退縮到閉臂中。而空白對(duì)照組大鼠則在開臂停留更多的時(shí)間，對(duì)開臂的探究次數(shù)也相對(duì)較多。提示SPS可致大鼠較長(zhǎng)時(shí)間的焦慮反應(yīng)，大鼠探究行為抑制、回避和恐懼、焦慮水平增高。

OF實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)動(dòng)物焦慮、恐懼水平的經(jīng)典方法，用來(lái)評(píng)定動(dòng)物的警覺(jué)水平、焦慮狀態(tài)和環(huán)境適應(yīng)能力[6-7]。如果大鼠的焦慮、恐懼水平高則傾向于停留在外周區(qū)，對(duì)中央?yún)^(qū)的探究次數(shù)及時(shí)間就會(huì)減少;反之，對(duì)中央?yún)^(qū)的探究次數(shù)及時(shí)間就會(huì)增多。SPS大鼠在OF實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為水平活動(dòng)度、活動(dòng)次數(shù)、中央停留時(shí)間明顯減少。說(shuō)明SPS大鼠對(duì)中心區(qū)域的恐懼水平明顯增高，較快退避至相對(duì)安全的外周區(qū)。

MWM通過(guò)測(cè)量動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)、記憶能力，可以更全面地了解動(dòng)物空間認(rèn)知的加工過(guò)程[8-9]，觀察應(yīng)激的影響作用。在MWM實(shí)驗(yàn)中SPS大鼠的尋臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，而在靶象限花費(fèi)時(shí)間的百分比和穿臺(tái)次數(shù)明顯減少。提示SPS可以引發(fā)大鼠長(zhǎng)期的學(xué)習(xí)和記憶能力受損，與臨床PTSD患者存在的長(zhǎng)期認(rèn)知功能受損頗為相似。

從進(jìn)化的角度講，SPS大鼠所表現(xiàn)的防御反應(yīng)是人類恐懼和焦慮反應(yīng)的原始成分。因此，本實(shí)驗(yàn)中SPS大鼠所表現(xiàn)的對(duì)環(huán)境探究行為的抑制、回避反應(yīng)與人類經(jīng)歷重大應(yīng)激事件后的焦慮、恐懼反應(yīng)是相似的。人類的焦慮反應(yīng)主要表現(xiàn)為逃避現(xiàn)實(shí)、逃跑行為、警覺(jué)性提高，同樣的行為反應(yīng)也可從本實(shí)驗(yàn)SPS大鼠身上觀察到。本模型成功模擬了PTSD的系統(tǒng)癥狀，如明顯和較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)SPS的恐懼、高警覺(jué)性、逃跑行為、環(huán)境適應(yīng)能力下降以及焦慮行為、空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙。模型制作過(guò)程中，單次足夠強(qiáng)度的應(yīng)激源及不可預(yù)測(cè)性是模型成功的關(guān)鍵，多種不可預(yù)測(cè)的應(yīng)激因子聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生理想的效果[10]。本研究通過(guò)SPS成功誘發(fā)了動(dòng)物多種PTSD樣精神和行為異常表現(xiàn)。該模型與PTSD有相似的致病因素與發(fā)生過(guò)程，效應(yīng)持久，為進(jìn)一步研究PTSD發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)提供了必要條件。

[1]Fortuna LR，Porche MV，Alegría M.A qualitative study of clinicians'use of the cultural formulation model in assessing posttraumatic stress disorder[J].Transcult Psychiatry，2009，46(3):429-450.

[2]Wang M，Armour C，Li X，et al.The factorial invariance across gender of three well-supported models:further evidence for a five-factor model of posttraumatic stress disorder[J].J Nerv Ment Dis，2013，201(2):145-152.

[3]Cohen H，Matar MA，Buskila D，et al.Early post-stressor intervention with high-dose corticosterone attenuates posttraumatic stress response in an animal model of posttraumatic stress disorder[J].Biol Psychiatry，2008，64(8):708-717.

[4]Kalynchuk LE，Pinel JP，Meaney MJ.Serotonin receptor binding and mRNA expression in the hippocampus of fearful amygdala-kindled rats[J].Neurosci Lett，2006，396(1):38-43.

[5]Golub Y，Mauch CP，Dahlhoff M，et al.Consequences of extinction training on associative and non-associative fear in amousemodelofPosttraumaticStressDisorder(PTSD)[J].Behav Brain Res，2009，205(2):544-549.

[6]Rubin DC，Berntsen D，Bohni MK.A memory-based model of posttraumatic stress disorder:evaluating basic assumptions underlying the PTSD diagnosis[J].Psychol Rev，2008，115(4):985-1011.

[7]Yamamoto S，Morinobu S，Takei S，et al.Single prolonged stress:toward an animal model of posttraumatic stress di-sorder[J].Depress Anxiety，2009，26(12):1110-1117.

[8]Unceta N，Barrondo S，Ruiz de Azúa I，et al.Determination of fluoxetine，norfluoxetine and their enantiomers in rat plasma and brain samples by liquid chromatography with fluorescence detection[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，852(1/2):519-528.

[9]Pinna G，Rasmusson AM.Up-regulation of neurosteroid biosynthesis as a pharmacological strategy to improve behavioural deficits in a putative mouse model of post-traumatic stress disorder[J].J Neuroendocrinol，2012，24(1):102-116.

[10]Yu H，Watt H，Kesavan C，et al.Lasting consequences of traumatic events on behavioral and skeletal parameters in a mouse model for post-traumatic stress disorder(PTSD)[J].PLoS One，2012，7(8):e42684.