食品中磺胺類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

何紅春

（高郵市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇 高郵225600）

1 引言

磺胺類（Sulfonamides，SAs）是具有對(duì)氨基苯磺酸苯磺酰結(jié)構(gòu)的合成抗菌素的總稱，是合成的抑菌藥，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性和許多革蘭氏陰性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用[1～7]，具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、體內(nèi)分布廣、制造不需糧食作原料、產(chǎn)量大、品種多、價(jià)格低、使用簡(jiǎn)便、供應(yīng)充足等優(yōu)點(diǎn)，目前仍是獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中最常用的藥物添加劑之一，在食源性動(dòng)物的飼養(yǎng)中被廣泛應(yīng)用。人類經(jīng)常食用有磺胺類藥物殘留的動(dòng)物源性食品，可能引起磺胺類藥物在體內(nèi)的逐漸累積。其危害性主要表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌作用以及激素樣作用等。目前中國(guó)、歐盟、美國(guó)、日本等均將磺胺類藥物列為動(dòng)物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物。日本把磺胺類最大殘留限量從100μg/kg降為50μg/kg，歐盟規(guī)定牛奶和肉類食品磺胺類藥物總量≤100μg/kg[8]。美國(guó)規(guī)定牛奶中磺胺類藥物的MRLs為10μg/L。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年12月發(fā)布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定牛奶中磺胺類藥物的最高殘留限量為0.1 mg/L[9]。

目前，針對(duì)磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)方法有薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）法、液質(zhì)聯(lián)用（HPLCMS、HPLC－MS/MS）、氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC－MS、GC－MS/MS）；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、膠體金免疫技術(shù)（Immune colloidal gold technique）和毛細(xì)管電泳（HPCE）法等。

2 作用機(jī)制和毒理學(xué)性質(zhì)

磺胺類藥物作用的靶點(diǎn)為細(xì)菌的二氫葉酸合成酶，使其不能充分利用對(duì)氨基苯甲酸合成葉酸。二氫葉酸合成酶催化的是對(duì)氨基苯甲酸、谷氨酸及二氫蝶啶焦磷酸或?qū)Π被郊柞９劝彼崤c二氫蝶啶焦磷酸合成二氫葉酸的反應(yīng)，二氫葉酸再經(jīng)二氫葉酸還原酶作用還原生成四氫葉酸，四氫葉酸可進(jìn)一步合成葉酸輔酶F，為細(xì)菌DNA中核苷酸的合成提供一碳單位。

磺胺藥與對(duì)氨基苯甲酸產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，從而阻止了細(xì)菌二氫葉酸的合成，進(jìn)而抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。

大多數(shù)磺胺類藥物可廣泛滲入全身組織和細(xì)胞外液，能透過血腦屏障進(jìn)入腦脊液。主要在肝臟內(nèi)乙?；癁闊o(wú)抗菌活性代謝產(chǎn)物，但仍有磺胺類毒性，可在中性或酸性條件下沉淀為結(jié)晶尿，損傷腎臟。主要經(jīng)腎小球?yàn)V過而排泄，部分藥物可經(jīng)腎小管重吸收。有少量從乳汁、膽汁和糞便排出。腎功能障礙時(shí)，母體化合物和代謝產(chǎn)物可在體內(nèi)積累，也可由于腎臟排出緩慢而增強(qiáng)乙?；饔脧亩鴮?dǎo)致毒性增大。

3 檢測(cè)方法進(jìn)展

3.1 儀器分析法

3.1.1 液相色譜分析法

高效液相色譜法是分析磺胺類藥物殘留的國(guó)際公認(rèn)方法，具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)[10～14]。

何紅梅等[10]采用C18色譜柱（250mm×4.6mm）作固定相，以乙腈（A）及乙腈＋乙酸＋水（20＋1＋79）的混合液（B）按不同比例作流動(dòng)相進(jìn)行梯度淋洗使5種磺胺藥物分離，最后在270nm波長(zhǎng)處作紫外檢測(cè)。方法的測(cè)定下限（S/N＝10）為0.04mg/kg，以豬肉樣品為基體加入3種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收試驗(yàn)，測(cè)得回收率在73.65%～93.45%之間。

劉海新等[11]建立了鰻魚肌肉中磺胺類藥物殘留的高效液相色譜柱后衍生分析方法。樣品經(jīng)乙腈和水提取，液－液分配和固相萃取凈化濃縮后，采用高效液相色譜柱后衍生法檢測(cè)磺胺類藥物經(jīng)C18色譜柱分離，在柱后反應(yīng)單元中與熒光胺反應(yīng)，生成具有熒光特性的分子，熒光檢測(cè)器檢測(cè)方法定量檢測(cè)限為2.0μg/kg，回收率為85.1%～90.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.74%～6.04%。

張萍等[12]采用固相萃?。咝б合嗌V法同時(shí)測(cè)定雞蛋粉中12種磺胺類藥物殘留量，樣品用乙腈提取，正己烷脫脂，抽干，鹽酸酸化，過WatersOasisMCX小柱凈化，用甲醇淋洗雜質(zhì)，6%的氨化甲醇溶液洗脫磺胺類藥物，洗脫液氮?dú)獯蹈?，流?dòng)相溶解后上HPLC儀分析，雞蛋粉中12種磺胺藥物的最小檢出限在0.002～0.045μg/g。

林海丹等[13]研究了動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹啉藥物殘留的提取、凈化和高效液相色譜分析條件，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留的方法，該法檢出限為0.010×10－6～0.020×10－6（w），添加回收率為71%～83%。

余輝菊等[14]采用新的樣品前處理方法：基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)對(duì)牛奶中殘留的磺胺類藥物進(jìn)行提取和凈化，HPLC法測(cè)定。8種磺胺類藥物的回收率在68.3%～101.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.4%～7.6%之間，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、快速，定性定量準(zhǔn)確，分析成本低，易于推廣應(yīng)用。

高效液相色譜檢測(cè)方法分析食品中藥物殘留，樣品前處理步驟往往占去整個(gè)分析時(shí)間的70%～90%，成為制約食品分析速度的瓶頸。而且樣品前處理用大量有機(jī)溶劑提取，對(duì)人體傷害比較大，分析周期長(zhǎng)，所以不適用藥物的快速檢測(cè)。

3.1.2 液質(zhì)聯(lián)用分析法

近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，聯(lián)用技術(shù)在磺胺藥物殘留分析中，不但能提供結(jié)構(gòu)信息，而且靈敏度高，選擇性好，特異性強(qiáng)，因此越來(lái)越用于磺胺類藥物殘留的確證分析[15～18]。

蔣原等[15]利用高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定了蜂蜜、蜂王漿、鮰魚、鰻魚、豬肉、豬腎、豬肝、雞肉、牛肉和牛奶中的三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧芐氨嘧啶和奧美普林3種磺胺類藥物增效劑。通過實(shí)際樣品添加回收實(shí)驗(yàn)，所有基質(zhì)定量下限為5.0μg/kg，3個(gè)添加水平的回收率為63%～89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～6.9%。

范瑩瑩等[16]建立一種用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定豬肉組織中磺胺類藥物殘留的方法。樣品經(jīng)2%的醋酸水溶液提取后通過固相萃取柱凈化，用甲醇洗脫，吹干，然后用流動(dòng)相A溶解，用DAD及MS檢測(cè)器檢測(cè)。該方法回收率范圍為55.3%～102.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.79% ～10.4%之間，方法的最低檢出限為0.1～0.5ppb。

陳瑩等[17]采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)鰻魚中大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留量進(jìn)行測(cè)定的同時(shí)測(cè)定鰻魚組織。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量，在酸化條件下用乙腈提取，經(jīng)正己烷除油，檢出限為0.1～0.2μg/kg，回收率60%～97%，相對(duì)偏差不大于12.6%，線性回歸相關(guān)系數(shù)在0.9974～0.9999之間。

吳西梅等[18]用高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜（ESIMSn）測(cè)定肉品中的磺胺二甲嘧啶，通過多級(jí)質(zhì)譜對(duì)陽(yáng)性樣品確證。以二級(jí)碎片做定量離子，磺銨二甲嘧啶測(cè)定線性范圍為25～400μg/L，最低檢出濃度為5μg/L。該方法簡(jiǎn)便快速，檢出限低。

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀法測(cè)定磺胺類藥物殘留，由于以子離子和母離子定性和定量，能夠假陽(yáng)性，而且樣品前處理比液相色譜簡(jiǎn)單，不需要衍生化，離子碎片特征性強(qiáng)，提供的信息豐富，靈敏度高，檢出限低，能夠達(dá)到歐盟和日本等對(duì)進(jìn)口水產(chǎn)品最高殘留量的要求，但是其儀器設(shè)備的購(gòu)置和運(yùn)行費(fèi)用較高，成為常規(guī)分析方法尚有待進(jìn)一步研究。

3.2 免疫分析法

由于近代免疫學(xué)和免疫技術(shù)的快速發(fā)展，免疫分析法成為近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種藥物殘留的檢測(cè)方法。免疫分析法是以抗原和抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，適用于組織中痕量組分的分析，可以用于規(guī)?；暮Y選。目前用于磺胺類藥物殘留檢測(cè)的免疫分析法主要放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)免疫分析（ELISA）兩種，此類方法不僅靈敏度高、準(zhǔn)確性好，同時(shí)還具有操作簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)成本低、適用于大批量樣品檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。

3.2.1 放射免疫分析法

放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）是較早應(yīng)用的一種免疫分析技術(shù)，利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原同抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)的放射性同位素體外微量分析方法，又稱競(jìng)爭(zhēng)性飽和分析法。RIA法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏、特異、簡(jiǎn)便易行、用樣量少等，缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽(yáng)性反應(yīng)，組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶和鹽及pH有時(shí)會(huì)影響結(jié)果等。傳統(tǒng)的放射免疫分析法檢測(cè)磺胺類藥物殘留，檢出限較高，所以應(yīng)用較少。林杰等[19]人曾應(yīng)用charm放射免疫分析法測(cè)定了商品蝦中磺胺類藥物殘留，并探討了檢測(cè)過程中時(shí)間因素對(duì)樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)的影響。

3.2.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡(jiǎn)稱酶聯(lián)免疫法，它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來(lái)檢測(cè)。酶聯(lián)免疫試劑盒是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。由于ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒）具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。萬(wàn)宇平等[20]在常規(guī)酶聯(lián)免疫法的基礎(chǔ)上，將磺胺類母核與牛血清白蛋白合成免疫抗原后免疫小鼠制得磺胺類單克隆抗體，并進(jìn)一步優(yōu)化抗體工作濃度、反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、精確的磺胺類殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，與常規(guī)ELISA方法相比，檢測(cè)限和靈敏度基本一致，但反應(yīng)時(shí)間縮短了60min，證明采用一步式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)磺胺類殘留可以大幅度縮減檢測(cè)時(shí)間，符合快速檢測(cè)的要求。

3.2.3 膠體金免疫分析法

膠體金免疫技術(shù)（Immune colloidal gold technique）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫分析方式，是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，它具有簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。李奎等[21]人采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用膠體金標(biāo)記抗磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)單克隆抗體，磺胺類藥物競(jìng)爭(zhēng)物包被于硝酸纖維素膜，制成免疫層析快速檢測(cè)試紙條，該方法可以在15min內(nèi)完成對(duì)磺胺類藥物的半定量殘留檢測(cè)，可作為磺胺類藥物殘留的快速篩選方法。

藥物殘留檢測(cè)試劑盒具有簡(jiǎn)便迅速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能滿足磺胺類藥物殘留的快速檢測(cè)的要求。由于磺胺類藥物是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，必須連接到大分子載體上產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，所以藥物殘留試劑盒在穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度方面存在一定的局限性，檢測(cè)過程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，所以限制了其應(yīng)用。

4 研究展望

磺胺類藥物殘留的檢測(cè)從早期的分光光度法、熒光法、到近些年的色譜分析、質(zhì)譜的分析法、毛細(xì)管電泳法和超臨界流體色譜法，幾乎所有的分析理論和技術(shù)在SAs殘留分析中都得到了研究和應(yīng)用，其中采用最多的篩選方法是反相高效液相色譜法（HPLC），后來(lái)發(fā)展的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試方法（EL ISA）作為篩選方法也得到了廣泛的應(yīng)用。

隨著人們對(duì)水產(chǎn)類食品安全問題的日益關(guān)注，對(duì)獸藥殘留檢測(cè)方法的精確度、時(shí)效性要求越來(lái)越高，人們不斷地探索研究新技術(shù)并將其應(yīng)用于磺胺類藥物殘留的檢測(cè)。儀器分析法在藥物殘留方面的檢測(cè)會(huì)越來(lái)越受到重視，液相色譜法具有高靈敏度、低檢出限、準(zhǔn)確重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，在今后一段時(shí)間內(nèi)，還是磺胺類藥物檢測(cè)的常用方法。液質(zhì)聯(lián)用法前處理比較簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，靈敏度高，檢出限低，滿足檢測(cè)要求，但是成本比較高，儀器價(jià)格昂貴，是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。隨著技術(shù)的提高，酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定藥物殘留能夠大大提高檢測(cè)效率和滿足多樣品的同時(shí)檢測(cè)。隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，其會(huì)更為簡(jiǎn)便實(shí)用，標(biāo)準(zhǔn)化免疫法能夠成為藥物殘留的快速檢測(cè)方法。

食品中磺胺類藥物殘留關(guān)乎人民群眾的生命健康，僅僅提高檢測(cè)技術(shù)是不行的，要提高廣大民眾的認(rèn)識(shí)，建立健全法制法規(guī)，廣泛宣傳增強(qiáng)法制觀念，嚴(yán)懲觸犯食品安全的企業(yè)和個(gè)人，切實(shí)提高我國(guó)食品安全水平。

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