水體中微囊藻毒素檢測技術研究進展

張從文，李紅梅，2，尤繼明，2，江 浩，2

（1.江蘇省寶應縣產品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇 寶應225800；2.江蘇省寶應縣國家有機食品質量監(jiān)督檢驗中心，江蘇 寶應225800）

1 引言

我國各種水體富營養(yǎng)化十分嚴重。水體富營養(yǎng)化導致的藍藻水華，不僅破壞了健康、平衡的水生生態(tài)系統(tǒng)，而且因藻細胞破裂后釋放出微囊藻毒素（Microcystin，MC）［1～7］、節(jié)球藻毒素（Nodularia）、束絲藻毒素（Aphantoxin）等多種毒素而對飲用水的安全構成了嚴重的威脅［8～12］。

在所有藍藻毒素中MC是淡水中產生量最大、分布最廣泛和造成危害最嚴重的藻毒素類型。微囊藻毒素主要存在于微囊藻（Microcystis）、魚腥藻（Anabaena）、顫藻（Oscillatoria）和念珠藻（Nostoc）中，也有人從眠狀軟管藻（Hapalosiphon hibernicus）中分離到了MC。MC正常情況下存在于藍藻的細胞內，只有當細胞死亡或破裂后才會釋放到周圍水體中［8，9］。MC基本結構是由7個氨基酸組成的單環(huán)多肽，也稱7肽單環(huán)肝毒素，相對分子量在1000左右，由于多肽可變位置上氨基酸種類的變化，導致了MC的多樣性。目前已發(fā)現(xiàn)了60多種不同類型的MC。MC均含有一種特殊的3－氨基－9－甲氨基－2，6，8－三甲基－10－苯基－4，6－癸二烯酸 （Adda）。在天然水體中發(fā)現(xiàn)最多，檢出頻率最高，毒性較大的是MC－LR、RR和YR（L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）。

目前，水中微囊藻毒素檢測方法很多，大致分為三類：①化學法，包括薄層層析法（TLC），液相色譜法（LC）［13～16］，液質聯(lián)用法（HPLC－MS）［17～19］，毛細管電泳法（CE）等；②生物法，包括生物體法，酶抑制－蛋白磷酸酶PP1／PP2A法；③免疫化學法，包括放射免疫法（RIA），間接競爭酶聯(lián)免疫法（idc－ELISA），直接競爭酶聯(lián)免疫法（dc－ELISA），夾心免疫法（Sandwich－ELISA）。

2 化學法

2.1 薄層層析法（TLC）

薄層層析法是將固定相（如硅膠）薄薄地均勻涂敷在底板（或棒）上，試樣點在薄層一端，在展開罐內展開，由于各組分在薄層上的移動距離不同，形成互相分離的斑點，測定各斑點的位置及其密度就可以完成對試樣的定性、定量分析的色譜法。

2.2 液相色譜法（LC）

高效液相色譜具有高壓、高速、高效、高靈敏度、應用范圍廣，更適宜于分離、分析高沸點、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用于各種分析檢測中。吳偉文［13］等采用固相微萃取與高效液相色譜法聯(lián)用技術分析了水溶液中痕量的微囊藻毒素，該方法測定MC－LR（LR型微囊藻毒素）的線性范圍為1.00～200μg／L，相關系數(shù)為0.999 5，檢出限為0.45μg／L，相對標準偏差（RSD）為2.4%，回收率為90%～99%。該方法測定MC－RR（RR型微囊藻毒素）的線性范圍為1.00～100μg／L，相 關系數(shù)為 0.9988，檢 出限為 0.15μg／L，RSD為2.4%，回收率為89%～100%。

郭堅［14］等建立了一種全自動化在線固相萃?。咝б合嗌V法快速、準確測定水體中3種痕量微囊藻毒素的新方法。樣品用自動進樣器連續(xù)注入固相萃取小柱完成富集后，通過雙梯度高效液相系統(tǒng)中的一個泵（上樣泵）實現(xiàn)凈化，再通過閥切換將固相萃取小柱切換至分析流路中，用另一個泵（分析泵）將待測物沖洗至分析柱進行測定。檢測波長為238nm，進樣體積為10mL，整個分析時間為20min。方法在0.5～10μg／L范圍線性良好，3種微囊藻毒素的線性相關系數(shù)R2＞0.9996，檢出限為0.1μg／L（S／N＞3），6次平行測定峰面積RSD＜1.6%，方法可有效應用于水體中痕量微囊藻毒素的測定。

戚莉莉［15］等建立了有效準確的檢測方法：流動相體積分數(shù)：35%乙腈＋65%水；體積流量：0.8～1.0 mL／min；紫外檢測波長239nm；進樣量10μL；在該條件下，以HPLC測定MC的檢測限值為0.1mg／L。并應用該法分析了2007年太湖藍藻爆發(fā)期間的水樣，結果表明方法具有實用性。

張立將［16］等選用甲醇－0.05%三氟乙酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，對MC－RR和MC－LR取得較好分離效果，水樣檢出限可達0.02μg／L。優(yōu)化后的前處理、檢測方法，對 MC－RR，MC－LR平均回收率分別為88.9%，并且優(yōu)化了前處理方法－冰乙酸處理法。

2.3 液質聯(lián)用法（HPLC－MS）

液相色譜－質譜聯(lián)用技術，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質譜部分和流動相分離，被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按質量數(shù)分開，經檢測器得到質譜圖。液質聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優(yōu)點結合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領域得到了廣泛的應用。

王蕾［17］等以實驗室培養(yǎng)銅綠微囊藻為原料，建立了固相萃取富集微囊藻毒素，液相色譜－電噴霧電離質譜測定藻樣中的微囊藻毒素 MC－LR的方法。該法絕對檢出限為25pg，回收率為70%以上，方法靈敏度高，實用性強。

王超［18］等利用固相萃取富集和凈化，經LC分離后，采用DAD和IT MS定性分析，DAD定量分析。在優(yōu)化的條件下，水中5種微囊藻毒素的檢出限為0.1μg／L；3個質量濃度加標水平（0.2、0.8和5μg／L）的平均回收率為52.2%～115.2%，相對標準偏差為1.2%～10.0%。

虞銳鵬［19］等通過固相萃取富集微囊藻毒素，并采用液相色譜－電噴霧電離質譜測定水中的微囊藻毒素－RR，－LR。分別在 m／z為520.4、996.3時，采用選擇離子掃描方式，提高檢測靈敏度。該法檢出限為0.01μg／L；線性定量范圍為0.02～20μg／L。該方法靈敏度高，實用性強，可為水質藻毒素風險評價和監(jiān)測水處理脫毒效能，提供靈敏、準確的分析方法。

化學分析法不僅能定量精確的檢測 MCs，可對不同的MC作精確定性定量測定，運用恰當可測到各組分的μg／L級的含量。但是由于化學分析方法需要復雜的前處理過程，并且所需的儀器價格昂貴，限制了它的實際應用。近年來，隨著新的萃取技術的出現(xiàn)，固相微萃取技術（SPME）、基質固相分散萃取技術（MSPDE）和免疫吸附萃取技術（IE）等也應用于MCs檢測的前處理中。這些技術高效、快速、節(jié)省時間，耗費有機溶劑極少甚至不用溶劑，提高了樣品中MCs的提取率，保證了檢測數(shù)據的準確性。

3 生物法

生物分析法用動物急性毒性實驗間接推算MC的含量，結果較為直觀、快速，但無法用于準確定量測定。蛋白磷酸酶法利用MC能夠抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A活性的特點，以磷酸化蛋白為底物，測定MCs對蛋白磷酸化酶的抑制程度，即測定MCs、磷酸化蛋白、蛋白磷酸化酶反應后釋放的磷酸鹽的量來檢測微囊藻毒素的量。蛋白磷酸酶法可以反映各種毒素的總量、檢測靈敏度高而且測定時間較短，在用于環(huán)境監(jiān)測時具有優(yōu)勢。但蛋白磷酸酶法的檢測限度是pg級，低于WHO標準，酶反應體系中的很多變量尚未進行量化和建立一個統(tǒng)一的標準，方法選擇性較差，對于各種MCs的靈敏度不同，只能測定毒素總量，無法分別測定不同種類毒素的量，也不能夠區(qū)分微囊藻毒素和其他的蛋白磷酸酶抑制劑，測定的是MCs的總量，如果藍藻本身具有內源蛋白磷酸酶活性，則有可能使PP1的結果偏低。此外，蛋白磷酸酶價格很昂貴，若自己制備則對設備和操作人員的要求非常高［20］。

4 免疫化學法

免疫檢測方法的原理是利用微囊藻毒素誘發(fā)免疫反應產生抗體，利用抗體對抗原的特異性識別來對各種毒素進行檢測。樣品處理簡單，便于操作，被國內外同行廣泛接受。近年來，免疫檢測方法已發(fā)展出多種單克隆抗體和多克隆抗體，用這兩種抗體制成的MCs酶聯(lián)免疫測試試劑盒已商品化。但是由于這些試劑盒所用抗體一般是針對MC－LR設計，使得它對于MCs其他異構體交叉反應性低，因此試劑盒對于許多天然存在的MCs靈敏度差異較大，不能檢測所有的毒素。而且酶聯(lián)免疫法假陽性出現(xiàn)幾率大，重現(xiàn)性差［21］。

5 問題與展望

在所有分析微囊藻毒素的檢測方法中色譜法結果穩(wěn)定可靠，操作簡單，是目前應用最多的方法，有廣闊地發(fā)展前景。但是如何檢測毒素國家尚未有一個標準方法，而且，天然水體中通常微囊藻毒素的濃度較低，因此，研究和發(fā)展低濃度藻毒素的分析鑒定方法以對其進行監(jiān)測十分重要。

通過研究不同介質中痕量MC的提取、富集方法，優(yōu)化樣品的前處理過程，利用高效、高靈敏的聯(lián)用技術和多殘留組分確證技術分析MC－RR、LR和YR，并且在此基礎上努力研究發(fā)展一些簡單、快速和便攜化的篩選多殘留分析技術將有助于水源受富營養(yǎng)化污染的城市之供水部門發(fā)展新的水質監(jiān)測分析技術，控制供水水質，保障人民的安全與健康。

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