扁滸苔（Ulva compressa）的分子鑒定及生活史的初步研究

蔡永超，馬家海，高嵩，杜晶，王丁晶

（上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

扁滸苔隸屬于綠藻門，綠藻綱，石莼目，石莼科，石莼屬。藻體亮綠色或暗綠色，管狀，常扁壓，高10～30 cm，甚至可達(dá)40 cm，有許多分枝，基部分枝較密，上部漸疏。分枝簡單圓柱狀或上部開展，分歧處略縊縮，直上部較粗大，與主枝的形狀和大小相似。細(xì)胞表面觀為角圓的亞方或長方形，直徑10～27 cm，排列無序，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有蛋白核1個(gè)（曾呈奎等，2009）。但是，石莼屬種內(nèi)劃分的傳統(tǒng)方法是依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類，由于石莼屬具有種類多、分布廣、形態(tài)特征復(fù)雜，而且許多形態(tài)特征隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此，難以準(zhǔn)確鑒定石莼屬內(nèi)種類（Malta et al，1999；Blomster et al，1998）。如 U.intestinalis通常沒有分枝或者藻體下部稍有分枝，而U.compressa有分枝，但是低鹽或鹽休克可以誘導(dǎo) U.intestinalis形成分枝（Blomster et al，1998）。針對這一問題，本文采用了分子鑒定的方法，保證了生活史研究所需藻體種的確定性和可靠性。

在生活史研究方面，Nordby等（1972）認(rèn)為把U.mutabilis藻體切割成小的片段，可以提高孢子的形成（Nordbyetal，1972）；Hiraoka等（1988）通過在孔石莼（U.pertusa）藻體上打小圓孔取樣，快速誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的形成（Hiraokaetal，1988）；Dan 等（2002），Lin等（2008），Gao等（2009）都通過打孔取樣的方法，快速誘導(dǎo)了滸苔（U.prolifera）的生殖細(xì)胞的快速形成（Dan et al，2002；Lin et al，2008；Gao et al，2010）。此種方法大大縮短了生活史研究的周期。

綠潮藻連續(xù)爆發(fā)6年來，國內(nèi)在種類鑒定方面，采用分子生物學(xué)的方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)綠潮的組成種類包括滸苔（U.prolifera），扁滸苔（U.compressa），緣管滸苔（U.linza）和曲滸苔（U.flexuosa），其中滸苔（U.prolifera）為綠潮的優(yōu)勢種類，扁滸苔（U.compressa）為綠潮的組成種類之一（應(yīng)成琦等，2009；陳斌斌等，2012）；在生活史方面，對石莼屬（Ulva）的研究對象主要是滸苔（U.prolifera）和緣管滸苔（U.linza），如王曉坤等（2007）對滸苔的生活史進(jìn)行了初步的研究；馬家海等（2009）對緣管滸苔的生活史進(jìn)行了初步的研究；張華偉等（2011）對綠潮漂浮滸苔的繁殖特性進(jìn)行了研究。但是，國內(nèi)對扁滸苔（U.compressa）生活史研究的資料尚未見報(bào)道。本文通過實(shí)驗(yàn)觀察，對扁滸苔的生活史進(jìn)行了詳細(xì)的報(bào)道，旨在完善綠潮藻種類的研究和對綠潮的成因、防治及漂浮的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品于2011年11月-2012年6月采自江蘇及山東沿岸（表1）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表1 樣品信息樣品編號采集時(shí)間采集地點(diǎn)生長方式

1.2.1 樣品的采集與處理

所有野外采集的藻體就地清洗后放在裝有冰袋的保溫箱中冷藏保存并于24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，挑選健康的藻體進(jìn)行充氣培養(yǎng)。培養(yǎng)的條件為：溫度18℃，海水鹽度26.9，光照強(qiáng)度100～160μmol/（m2·s1），光照周期12L∶12D（8∶00-20∶00為光照時(shí)間，20∶00-8∶00為黑暗時(shí)間），PES營養(yǎng)液濃度為2%。對研究生活史所需要的藻體，參照Hiraoka等（1988）的處理方法并有所改動(dòng)。

1.2.2 DNA的提取及ITS序列的獲取

DNA制備方法參照Doyle等（1990），ITS序列的擴(kuò)增參考 Hayden等（2003）和 Shimada等（2008）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，通過紫外光檢測。引物有上海生物工程有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及測序由上海邁普生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 ITS序列的分析

采 用 Bioedit（Hall et al， 1999）和 ClustalX（Ver1.83）（Thompson et al，1994）對樣品 ITS 序列進(jìn)行編輯和對齊。同源性通過NCBI進(jìn)行BLAST檢測，獲取序列均來自GenBank，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用鄰接法，采用Kimura雙參數(shù)模型，使用軟件為MEGA 4.1，參考Tamura等（2007），自舉檢驗(yàn)值1 000次檢驗(yàn)節(jié)點(diǎn)置信度。

1.2.4 培養(yǎng)鏡檢

用1 000 uL移液器的槍頭在靠近扁滸苔藻體頂端的邊緣進(jìn)行打孔取樣，取下的小圓片藻體放置在培養(yǎng)皿中（高為18 mm，直徑為90 mm），加含有PES營養(yǎng)液的滅菌海水50 ml，培養(yǎng)的條件為：溫度18℃，海水鹽度26.9，光照強(qiáng)度100～160 μmol/（m2·s1），光照周期12L∶12D（8∶00-20∶00為光照時(shí)間，20∶00-8∶00 為黑暗時(shí)間），每天8∶00到13∶00，用Olympus顯微鏡對其進(jìn)行顯微觀察及拍照。

1.2.5 配子和孢子的趨光性

把成熟的生殖的藻體放在100 mL的小燒杯中，用手電筒將光線從錐形瓶的一側(cè)射入，鏡檢聚集地方的生殖細(xì)胞以測試其趨光性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ITS 系統(tǒng)發(fā)育分析

以ITS序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。12個(gè)樣品一共被分到了3個(gè)進(jìn)化枝，分別是LPP（U.linza-procera-prolifera）、U.compressa、U.flexuosa.其中LPP類群占有優(yōu)勢，包含7個(gè)樣品，U.compressa類群包含4個(gè)樣品，U.flexuosa類群包含1個(gè)樣品。

圖1 基于ITS序列所構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 扁滸苔（U.compressa）的生活史

2.2.1 孢子囊和配子囊的成熟過程

經(jīng)過3 d到4 d的培養(yǎng)，樣品的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了巨大的變化。小圓片藻體的正常細(xì)胞（圖版Ⅰ-1），經(jīng)過2 d左右，色素體分解為粒狀，并分布在整個(gè)細(xì)胞中（圖版Ⅰ-2），4 d左右，色素體融合，并集中在一個(gè)細(xì)胞的一邊，空泡形成（圖版Ⅰ-3），5 d左右，配子囊（圖版Ⅰ-4）和孢子囊（圖版Ⅰ-6）形成。

2.2.2 生殖細(xì)胞的數(shù)量及趨光性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扁滸苔的每個(gè)配子囊里含有16個(gè)配子（圖版Ⅰ-4-5），每個(gè)孢子囊里含有8個(gè)孢子（圖版Ⅰ-6-7）。將裝有一定量生殖細(xì)胞的錐形瓶置于電筒下，一段時(shí)間后燒杯內(nèi)大量生殖細(xì)胞在錐形瓶接近光源的一側(cè)聚集，形成一層綠色的膜（圖版Ⅰ-8），鏡檢可見大量的配子；在遠(yuǎn)離光源的區(qū)域發(fā)現(xiàn)少量的合子。由此可見，扁滸苔的配子具有正趨光性，而合子具負(fù)趨光性。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，慢慢形成簇生小苗（圖版Ⅰ-9）。

2.2.3 單性生殖、無性生殖及有性生殖的過程

通過實(shí)驗(yàn)觀察，扁滸苔的生殖方式包含以下幾種繁殖方式。單性生殖：配子體藻體放散的兩鞭毛配子（圖版Ⅱ-1）運(yùn)動(dòng)一段時(shí)間后，雌雄配子不經(jīng)過結(jié)合，直接附著后發(fā)育。放散的兩鞭毛配子可以直接在基質(zhì)上附著發(fā)育（圖版Ⅱ-2），也可以附著在原藻體上發(fā)育（圖版Ⅱ-3-4）。此外，有的配子囊未完全放散配子，配子囊里含有的一個(gè)（圖版Ⅱ-5）或多個(gè)（圖版Ⅱ-6-7）配子直接在藻體上發(fā)育。無性生殖：孢子體藻體放散的四鞭毛游孢子（圖版Ⅱ-8），游孢子運(yùn)動(dòng)一段時(shí)間找到合適的基質(zhì)后附著發(fā)育（圖版Ⅱ-9）。孢子囊同樣存在放散不完全，孢子于囊內(nèi)直接生長發(fā)育的現(xiàn)象（圖版Ⅱ-10）。有性生殖：配子體藻體放散兩鞭毛的配子，雌雄配子在結(jié)合的過程中，雌雄配子相互旋轉(zhuǎn)，色素體向尾部移動(dòng)，從頭部開始融合，然后雌性配子相互靠近，再從側(cè)面開始融合，最后完成彼此的融合，形成合子，合子慢慢變圓并附著發(fā)育（圖Ⅱ-11-16）。在雌雄配子融合的全過程，雌雄配子始終保持著同步的相互旋轉(zhuǎn)和移動(dòng)。此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，有性生殖過程中，雌雄配子的結(jié)合需要一定的外部環(huán)境和時(shí)間，所以這種生殖方式較為少見。游動(dòng)孢子和配子在進(jìn)行附著的過程中均具有聚集性（圖版Ⅱ-17），但兩鞭毛的配子比四鞭毛的孢子運(yùn)動(dòng)的更快，更易聚集附著發(fā)育，所以單性生殖又占有主導(dǎo)的地位。

圖版Ⅱ 扁滸苔的生活史

3 討論

在我國，按照傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法對石莼屬進(jìn)行分類，已報(bào)道的石莼屬中的滸苔有7種，包括滸苔（U.prolifera）、緣管滸苔（U.linza）、扁滸苔（U.compressa）、曲滸苔（U.flexuosa）、腸滸苔（U.intestinlis）、管滸苔（U.tubulosa）、條滸苔（U.clathrata），廣泛分布于東北亞沿海的近岸（Tseng et al，1983；楊君 等，2000；曾呈奎 等，1962；曾呈奎等，2009）。但是，本研究通過分子生物學(xué)的方法把所選的12個(gè)藻類樣品劃分為3個(gè)類群，即U.linza-procera-prolifera（LPP）復(fù)合體類群、U.compressa類群以及U.flexuosal類群。到目前為止，采用分子生物學(xué)方法只發(fā)現(xiàn)其中4種，為滸苔（U.prolifera），扁滸苔（U.compressa），緣管滸苔（U.linza）和曲滸苔（U.flexuosa）（應(yīng)成琦等，2009；陳斌斌等，2012），其余3種到底存不存在，以及是否是由于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法造成的還有待于進(jìn)一步的研究。因此，在今后的石莼屬藻類的種類鑒定中，考慮以現(xiàn)代的分子生物學(xué)方法為主，以形態(tài)學(xué)觀察為輔為參考，使得分子生物學(xué)方法和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法相輔相成，以便對綠藻種類的鑒定更為可靠。

扁滸苔是綠潮藻的組成種類，由于它的表面積一般較大，可以為綠潮藻的優(yōu)勢種滸苔及其他種類提供配子或者孢子的附著基質(zhì)，有利于這些藻體的快速繁殖。同時(shí)，海洋生物的攝食，人類的活動(dòng)，海浪潮汐等自然作用，都會(huì)導(dǎo)致扁滸苔破裂形成小片段藻體，這些產(chǎn)生的小片段的藻體可快速誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的產(chǎn)生，這就大大的增加了包括扁滸苔在內(nèi)的綠潮藻的繁殖速度，短時(shí)間內(nèi)形成大量的綠潮（Nordby et al，1972；Hiraoka et al，1998；Dan et al，2002；Lin et al，2008）。

在U.compressa的生活史中，無性生殖和單性生殖占有優(yōu)勢。因?yàn)椴徽撌窃跓o性生殖過程中的孢子還是單性生殖過程中的配子，一經(jīng)附著即可生長，無須經(jīng)過有性生殖雌雄配子的接合過程，這就縮短了繁殖周期，為藻體在短時(shí)間內(nèi)的快速生長提供了條件。此外配子囊和孢子囊放散配子和孢子的數(shù)量也是驚人的，在海況條件適宜的情況下，使U.compressa等漂浮綠藻大量繁殖，從而可能成為“綠潮”的成因之一。

本文在國內(nèi)首次報(bào)道了作為黃海海域漂浮綠藻種類之一的U.compressa的生活史，掌握其生活史將有助于了解、分析黃海海域漂浮綠藻大量迅速增殖的成因，同時(shí)為“綠潮”的預(yù)測、預(yù)報(bào)與防治提供了理論依據(jù)。

Blomster J，Maggs C A，Stanhope M J，1998.Molecular and morphological analysis of Enteromorpha intestinalis and E.compressa（Chlorophyta）in the British Isles.Journal of Physiology，34（2）：319-340.

Dan A，Hiraoka M，Ohno M，et al，2002.Observations on the effect of salinity and photon fluence rate on the induction of sporulation and rhizoid formation in the green alga Enteromorpha prolifera（Müller）J.Agardh（Chlorophyta，Ulvales）.Fisheries Science，68（6）：1182-1188.

DoyleJ J，DoyleJ L，1990.Isolation of plant DNA from fresh tissue.Focus，12（12）：13-15.

Gao S，Chen X Y，Yi Q，et al，2010.A strategy for the proliferation of Ulva prolifera，main causative species of green tides，with formation of sporangia by fragmentation.PLoS ONE，5（1）：e8571.

HallT A，1999.BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucleic Acids Symposium Series，41：95-98.

HaydenS H，Blomster J，Maggs A C，et al，2003.Linnaeus was right all along：Ulva and Enteromorpha are not distinct genera.European Journal of Phycology，38（3）：277-294.

Hiraoka M，Enomoto S，1998.The induction of reproductive cell formation of Ulv apertusa Kjellman（Ulvales，Ulvophyceae）.Phycological Research，46：199-203.

Lin A P，Shen S D，Wang J W，et al，2008.Reproduction diversity of Enteromorpha prolifera.Journal of Integrative Plant Biology，50（5）：622-629

Malta E J，Draisma S G A，Kamermans P，1999.Free-floating Ulva in the southwest Netherlands：species or morphotypes?A morphological，molecular and ecological comparison.European Journal of Phycology，34（5）：443-454.

Nordby ?，Hoxmark R C，1972.Changes in cellular parameters during synchronous meiosis in Ulva mutabilis F?yn.ExptI Cell Res.75：321-328.

Shimada S，Yokoyama N，Arai S，et al，2008.Phylogeography of the genus Ulva（Ulvophyceae，Chlorophyta），with special reference to the Japanese freshwater and brackish taxa.Journal of Applied Phycology，20（5）：979-989.

Tamura K，Dudley J，Nei M，et al，2007.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0.Molecular Biology and Evolution，24（8）：1596-1599.

Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J，1994.CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research，22（22）：4673-4680.

Tseng C K，1983.Common Seaweeds of China.Beijing：Science Press.

陳斌斌，馬家海，張?zhí)旆颍龋?012.中國沿海石莼屬綠藻的ITS和5SrRNA序列分析.海洋漁業(yè)，34（3）：249-255.

馬家海，嵇嘉民，徐韌，等，2009.長石莼（緣管滸苔）生活史的初步研究.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，33（1）：45-52.

王曉坤，馬家海，葉道才，等，2007.滸苔（Enteromorpha prolifera）生活史的初步研究.海洋通報(bào)，26（5）：112-116.

楊君，安利佳，王茜，等，2000.石莼屬（Ulva）與滸苔屬（Enteromorpha）綠藻的RAPD分析.海洋與湖沼，31（4）：408-413.

應(yīng)成琦，張婷，李信書，等，2009.我國近海滸苔漂浮種類ITS與18SrDNA序列相似性分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，33（2）：215-219.

曾呈奎，夏邦美，周顯銅，等，2009.中國黃渤海海藻.北京：科學(xué)出版社，389-390.

曾呈奎，張德瑞，張峻甫，等，1962.中國經(jīng)濟(jì)海藻志.北京：科學(xué)出版社，42-49.

張華偉，馬家海，胡翔，等，2011.綠潮漂浮滸苔繁殖特性的研究.上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，20（4）：600-606.