利用響應(yīng)面法優(yōu)化出芽短梗霉As3．933產(chǎn)普魯蘭多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

常 帆，薛文嬌，安 超，馬賽箭

（陜西省微生物研究所微生物代謝產(chǎn)物研究中心，陜西 西安710043）

普魯蘭多糖（Pullulan），又稱茁霉多糖、短梗霉多糖等，是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）發(fā)酵產(chǎn)生的一類多聚糖［1］，為右旋葡聚糖［2］。普魯蘭多糖是由麥芽三糖通過α－1，6－糖苷鍵連接形成的高分子量的線形多糖［3］，其中α－1，4－糖苷鍵與α－1，6－糖苷鍵的比例為2∶1，聚合度為200～5000，平均分子質(zhì)量為4．8×104～2．2×106Da［4］。普魯蘭多糖因其易溶于水、不凝膠化、可以任意加工成型、無毒性等特點應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等諸多行業(yè)［5，6］，尤其是作為食品添加劑應(yīng)用廣泛［7］。

利用出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭多糖時，碳源、氮源、營養(yǎng)因子、溶解氧水平、溫度和pH值等因素都影響其形態(tài)特征和產(chǎn)物的形成［8］。作者借助統(tǒng)計學軟件Design－Expert 8．0，采用響應(yīng)面設(shè)計法（RSM）對影響普魯蘭多糖產(chǎn)量的主要培養(yǎng)基參數(shù)進行優(yōu)化，以期為生產(chǎn)中提高普魯蘭產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 實驗

1．1 菌種與培養(yǎng)基

出芽短梗霉As3．933，中國科學院普通微生物保藏中心。

PDA固體培養(yǎng)基（g·L－1）：馬鈴薯200．0，葡萄糖20．0，瓊脂20．0。

液體種子培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖50．0，酵母膏2．5，NaCl 1．0，MgSO4·7H2O 0．2，K2HPO45．0，（NH4）2SO40．6，pH 值6．5。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L－1）：蔗糖50．0，酵母膏2．5，NaCl 1．0，MgSO4·7H2O 0．2，K2HPO45．0，（NH4）2SO40．6，pH 值6．5。

以上培養(yǎng)基均于115℃滅菌30min。

1．2 方法

1．2．1 出芽短梗霉種子培養(yǎng)

從保藏斜面挑取一環(huán)出芽短梗霉As3．933菌種接種于裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，于230r·min－1、28℃培養(yǎng)48h。

1．2．2 發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)普魯蘭多糖

將種子液以5%（2．5mL）接種量接入裝有50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于230r·min－1、28℃培養(yǎng)120h。

1．2．3 生物量和多糖含量的測定

將發(fā)酵液于6000r·min－1離心15min，沉淀用水洗滌2次后，105℃烘干至恒重。向上清液中加入2 BV無水乙醇，振蕩搖勻，4℃放置12h，10 000r·min－1離心5min，沉淀于80℃烘干至恒重，即得普魯蘭多糖粗品，稱量。

1．2．4 Plackett－Burman實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以粗普魯蘭多糖產(chǎn)量為指標進行Plackett－Burman實驗設(shè)計。選擇實驗次數(shù)N＝12，對蔗糖（X1）、（NH4）2SO4（X2）、酵母膏（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、NaCl（X5）、K2HPO4（X6）和pH值（X7）7個因素進行考察，另外取4個虛擬項進行誤差估計。每個因素取2個水平，高水平編碼為＋1，低水平編碼為－1。各因素水平取值見表1。以普魯蘭多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，每組3個平行，取平均值。用Design－Expert 8．0進行數(shù)據(jù)處理。

表1 Plackett－Burman實驗因素與水平／g·L－1Tab．1 Factors and levels of Plackett－Burman experiment／g·L－1

1．2．5 最陡爬坡實驗

最陡爬坡實驗以Plackett－Burman（PB）實驗的實驗值變化方向為爬坡方向，根據(jù)PB實驗結(jié)果設(shè)計步長，盡快逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1．2．6 響應(yīng)面分析

在最陡爬坡實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進行3因素3水平實驗，利用Design－Expert 8．0軟件優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

2 結(jié)果與討論

2．1 Plackett－Burman設(shè)計方案與結(jié)果

Plackett－Burman實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，各因素效應(yīng)及顯著性分析見表3。

由表3可知，對普魯蘭多糖產(chǎn)量產(chǎn)生正效應(yīng)的因素為蔗糖、MgSO4·7H2O、NaCl和 K2HPO4，產(chǎn)生負效應(yīng)的因素為（NH4）2SO4、酵母膏和pH值。而可信度在95%水平上時酵母膏、（NH4）2SO4和 K2HPO4差異顯著。

2．2 最陡爬坡實驗

Plackett－Burman 實 驗 結(jié) 果 表 明，（NH4）2SO4（X1）、酵母膏（X2）為負效應(yīng)，K2HPO（X3）4為正效應(yīng)根據(jù)效應(yīng)大小決定步長、其它因素分別取中心點水平，進行最陡爬坡實驗。最陡爬坡實驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

表2 Plackett－Burman實驗設(shè)計與結(jié)果Tab．2Design and results of Plackett－Burman experiment

表3 Plackett－Burman實驗結(jié)果分析Tab．3Significance analysis of Plackett－Burman experiment

表4 最陡爬坡實驗設(shè)計與結(jié)果Tab．4 Design and results of the steepest ascent experiment

由表4可知，（NH4）2SO40．65g·L－1、酵母膏2．6g·L－1、K2HPO47．05g·L－1時普魯蘭多糖產(chǎn)量最高，因此將第2組作為Box－Behnken的中心點進行進一步優(yōu)化。

2．3 Box－Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析

根據(jù)Plackett－Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的中心點，以普魯蘭多糖產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值對普魯蘭多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進行3因素3水平的Box－Behnken實驗，實驗的因素和水平見表5，設(shè)計和結(jié)果見表6。

表5 Box－Behnken實驗因素與水平／g·L－1Tab．5Factors and levels of Box－Behnken experiment／g·L－1

用 Design－Expert 8．0軟件對 Box－Behnken實驗結(jié)果進行二次回歸分析，得到的回歸方程為：Y＝21．6313＋1．3188 X1＋1．9666 X2－0．7932 X3－2．076－1．5833－1．5943－1．2165 X1X2＋1．6225 X1X3＋1．3133 X2X3。

表6 Box－Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Tab．6Design and results of Box－Behnken experiment

二次響應(yīng)模型的方差分析結(jié)果見表7。

表7二次響應(yīng)模型方差分析Tab．7 ANOVA for the secondary response model

模型的復相關(guān)系數(shù)的平方R2＝96．32%，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小。由表7可知，3個自變量和因變量之間線性關(guān)系顯著（P＜0．05），其中X2對Y值的影響達到極顯著水平；從交互作用來看，X1與X3交互作用顯著，而X1與X2、X2與X3之間的交互作用不顯著，表明因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值也有很大的關(guān)系，這和模型回歸中的線性、平方和交互性影響顯著相對應(yīng)。其中失擬項的P＝0．333（＞0．05），沒有顯著性影響，說明數(shù)據(jù)沒有異常點，模型適當。

根據(jù)Box－Behnken實驗結(jié)果繪制三維響應(yīng)面圖（圖1），可以看出該設(shè)計有最大值。利用Design－Expert 8．0軟件響應(yīng)優(yōu)化器進行放大，最大值處為：（NH4）2SO40．67g·L－1、酵母 膏 2．84g·L－1、K2HPO47．12g·L－1，在此條件下，普魯蘭多糖的理論最大產(chǎn)量為22．29g·L－1。采用上述優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進行3組平行實驗，實際測得的普魯蘭多糖產(chǎn)量分別為22．58g·L－1、21．98g·L－1、22．32g·L－1，平均值為22．29g·L－1，與預測值一致，說明基于響應(yīng)曲面法所得到的出芽短梗霉發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

圖1 各因素之間交互影響普魯蘭多糖產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線圖Fig．1 Response surface and contour plots showing the effects of three variables on production of pullulan

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett－Burman實驗篩選出影響菌株As3．933產(chǎn)普魯蘭多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的3個主要因素：酵母膏、（NH4）2SO4和 K2 HPO4，再利用最陡爬坡實驗逼近最大影響區(qū)域，最后通過Box－Behnken實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，確定最佳培養(yǎng)基組成為：蔗糖62．5g·L－1，（NH4）2SO40．67g·L－1，酵母膏2．84g·L－1，K2HPO47．12g·L－1，NaCl 1．25g·L－1，MgSO4·7H2O 0．25g·L－1，pH值6．5。優(yōu)化后的普魯蘭多糖產(chǎn)量達到22．29g·L－1，較初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基（17．32g·L－1）提高了28．70%。

［1］Ronen M，Guterman H，Shabtai Y．Monitoring and control of pullulan production using vision sensor［J］．Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2002，51（3）：243－249．

［2］Ian W S．Polysaccharases for microbial exopolysaccharides［J］．Carbohydrate Polymers，1999，38（4）：319－328．

［3］Singh R S，Saini G K．Production，purification and characterization of pullulan from a novel strain of Aureobasidium pullulans FB－1［J］．Journal of Biotechnology，2008，136（S）：506－507．

［4］Cheng K C，Demirci A，Catchmark J M．Pullulan：Biosynthesis，production，and applications［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2011，92（1）：29－44．

［5］Singh R S，Saini G K．Pullulan－h(huán)yperproducing color variant strain of Aureobasidium pullulans FB－1newly isolated from phylloplane of Ficus sp．［J］．Bioresource Technology，2008，99（9）：3896－3899．

［6］付湘晉，童群義．普魯蘭多糖的研究［J］．食品研究與開發(fā)，2005，26（6）：16－21．

［7］GB 28402－2012，食品安全國家標準 食品添加劑 普魯蘭多糖［S］．

［8］湯興俊，何國慶．茁霉多糖的微生物發(fā)酵及在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］．糧油加工與食品機械，2002，56（7）：34－36．