培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長及產(chǎn)D－乳酸的影響

滿永博，范季瀛，蘇 剛，饒 犇，沈亞領(lǐng)（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 魯華生物技術(shù)研究所，上海200237）

乳酸［1－4］是一種重要的有機(jī)酸，是合成多種物質(zhì)的基礎(chǔ)原料，同L－乳酸相比，D－乳酸的經(jīng)濟(jì)價(jià)值更大，除應(yīng)用在醫(yī)藥、日化和化學(xué)工業(yè)外，其更重要的應(yīng)用價(jià)值體現(xiàn)在可以改良聚乳酸特性［5］，提升其熔點(diǎn)并延長降解時(shí)間。高光學(xué)純度D－乳酸市場(chǎng)需求量大且價(jià)格昂貴，有良好的經(jīng)濟(jì)效益。

目前，化學(xué)合成法生產(chǎn)D－乳酸存在諸如工藝復(fù)雜、成本高、聚合物光學(xué)純度低等缺點(diǎn)［6］；生物催化法原料昂貴且應(yīng)用范圍??；發(fā)酵法［7］生產(chǎn)D－乳酸是較好的生產(chǎn)工藝，多數(shù)細(xì)菌代謝途徑中存在葡萄糖代謝生成乳酸的途徑，且發(fā)酵工藝的原料來源廣泛、價(jià)格低廉［8］，具有廣闊的應(yīng)用前景。工業(yè)生產(chǎn)高光學(xué)純度D－乳酸的菌株大多為乳酸菌屬，該菌屬乳酸產(chǎn)量高，但其培養(yǎng)基成分復(fù)雜、培養(yǎng)條件苛刻，因而生產(chǎn)成本較高［9］。因此，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分［10］，獲得廉價(jià)、高效的培養(yǎng)基配方具有現(xiàn)實(shí)意義。

與乳酸菌屬相比，粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）［11］培養(yǎng)條件要求較低，培養(yǎng)基組分相對(duì)簡(jiǎn)單、廉價(jià)，在轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率上具有優(yōu)勢(shì)。作者首次選用粘質(zhì)沙雷氏菌作為乳酸生產(chǎn)菌，考察了其培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分對(duì)菌體生長及D－乳酸產(chǎn)量的影響，擬為深入研究其代謝途徑［12，13］及產(chǎn)物提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 菌株

重組粘質(zhì)沙雷氏菌 R1（Serratia marcescens R1，KnR，α－乙酰乳酸合成酶基因缺失），本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，甘油懸液保藏法保存于－80℃冰箱。

1．2 方法

（1）菌株活化：取1mL菌液接種至裝液量為50 mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，置于28℃、200r·min－1搖床培養(yǎng)12h。取適量菌體稀釋后涂布于種子培養(yǎng)基平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h至長出單菌落。

（2）種子培養(yǎng)：從固體培養(yǎng)基平板上挑取生長良好的單菌落接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，加入適量卡那霉素以防止染菌，置于28℃、200 r·min－1搖床培養(yǎng)12h，得種子培養(yǎng)液。如有需要，再次轉(zhuǎn)接種子制成二級(jí)種子培養(yǎng)液備用。

（3）搖瓶發(fā)酵：按照5%接種量，轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)液至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，加入適量卡那霉素防止染菌，分兩階段培養(yǎng)：第一階段28℃、200r·min－1搖床培養(yǎng)12h左右；其后，調(diào)節(jié)適合溫度靜置厭氧培養(yǎng)產(chǎn)酸，添加軟性碳酸鈣或4mol·L－1堿液維持一定pH值。

1．3 分析測(cè)試

1．3．1 葡萄糖濃度測(cè)定

取適量培養(yǎng)上清液稀釋N倍后振蕩混勻，使其葡萄糖濃度在1g·L－1左右。取兩支試管，各加入葡萄糖試劑1mL后，分別加入10μL校準(zhǔn)液及待測(cè)液于試管中，37℃水浴10min后，用1．0cm比色杯（用空白管調(diào)零點(diǎn)），于505nm處測(cè)定其吸光度值，校準(zhǔn)液記為A0，待測(cè)液記為A。按式（1）計(jì)算上清液葡萄糖濃度S（g·L－1）：

1．3．2 菌體濃度的測(cè)定

取微量不同生長階段的菌液，適當(dāng)稀釋N倍使得其吸光度值A(chǔ)處于0．2～0．8范圍內(nèi)，測(cè)其在600nm處的吸光度值。菌體濃度OD600＝A×N，根據(jù)干重標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為菌體干重。

1．3．3 乳酸濃度測(cè)定

采用島津高效液相色譜儀測(cè)定發(fā)酵液中乳酸濃度。

色譜 條 件：Bio－Rad Aminex HPX－87H 色 譜 柱（300mm×7．8mm）；流動(dòng)相5mmol·L－1H2SO4；流速0．6mL·min－1；進(jìn)樣量50μL；柱溫65℃。

液相色譜法測(cè)定結(jié)果為總?cè)樗釢舛?，采用乳酸試劑盒法?zhǔn)確測(cè)定各對(duì)映體構(gòu)型乳酸濃度，同時(shí)與液相色譜法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。測(cè)定原理如下［14］：

由上述反應(yīng)式可知，NADH的生成量與乳酸的量等摩爾，NADH的量可以通過測(cè)定其在340nm處吸光度值的變化量ΔA獲得。

按c＝0．3204×ΔA分別計(jì)算出L－乳酸和D－乳酸的濃度，則光學(xué)純度POptical按式（2）計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2．1 培養(yǎng)條件的確定

2．1．1 培養(yǎng)溫度、pH 值的影響

細(xì)菌厭氧發(fā)酵有機(jī)酸過程中，隨著厭氧培養(yǎng)的進(jìn)行，菌體所消耗糖類轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，后者的積累會(huì)致使培養(yǎng)環(huán)境中的pH值降低，抑制菌體胞內(nèi)有機(jī)酸代謝過程中關(guān)鍵酶的活性，降低菌體利用基質(zhì)的速率并改變菌體細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)等，對(duì)目的產(chǎn)物的生成造成不利影響?？疾炫囵B(yǎng)溫度及pH值對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 培養(yǎng)溫度（a）和pH值（b）對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響Fig．1 Effects of culture temperature（a）and culture pH value（b）on biomass and lactic acid yield

由圖1a可知，培養(yǎng)溫度在28～34℃范圍內(nèi)，菌體量、乳酸產(chǎn)量均隨培養(yǎng)溫度升高而增大，超過34℃后，菌體量、乳酸產(chǎn)量均急劇下降。同時(shí)，菌體在相對(duì)低培養(yǎng)溫度條件下的耗糖量更大。從菌體生長方面考慮，應(yīng)該控制培養(yǎng)溫度低于34℃，此時(shí)，菌體量大且殘?zhí)橇康徒趿?。因此，選擇培養(yǎng)溫度為34℃。

由圖1b可知，偏堿性（pH值＞7．5）培養(yǎng)條件和偏酸性（pH值＜6．5）培養(yǎng)條件下的乳酸產(chǎn)量和菌體量均低于近中性條件，且堿性培養(yǎng)條件需要中和劑維持，增加成本。在粘質(zhì)沙雷氏菌生長及代謝過程中，近中性（pH值7．5～6．5）培養(yǎng)條件下，乳酸產(chǎn)量及菌體量均較大。但pH值6．5培養(yǎng)條件可以減少中和劑的加入，降低成本。因此，選擇pH值為6．5。

2．1．2 溶氧的影響

粘質(zhì)沙雷氏菌作為兼性好氧菌，在有氧及無氧條件下均可以生長，但在無氧條件下發(fā)酵生成乳酸。搖瓶實(shí)驗(yàn)中的溶氧狀況和載液量相關(guān)，載液量的增加意味著溶氧及傳質(zhì)速率的下降?？疾燧d液量對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 載液量對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響Fig．2 Effects of loaded liquid on biomass and lactic acid yield

由圖2可知，隨著載液量的增加，乳酸產(chǎn)量和菌體量均增大，載液量為150mL／500mL時(shí)，乳酸產(chǎn)量最大，達(dá)10．35g·L－1；但載液量超過150mL／500mL后，乳酸產(chǎn)量略微下降，而菌體量急劇下降。50mL／500mL裝液量下，原本最利于氧的傳遞及菌體的生長，但總營養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)偏少，其菌體量及乳酸產(chǎn)量較低。因此，選擇載液量為150mL／500mL。

2．2 培養(yǎng)基的確定

2．2．1 碳、氮源的選擇［15］（圖3）

圖3 碳源（a）和氮源（b）對(duì)菌體量及乳酸產(chǎn)量的影響Fig．3 The effects of carbon sources（a）and nitrogen sources（b）on biomass and lactic acid yield

由圖3a可知，菌株的碳源譜較廣，可利用多種碳源。其中以葡萄糖、蔗糖和乳糖為碳源的菌體量及乳酸產(chǎn)量均優(yōu)于甘油、淀粉和纖維素水解液。葡萄糖相對(duì)廉價(jià)，作為碳源培養(yǎng)微生物，菌體生長迅速且代謝途徑清楚，利于分析代謝過程及計(jì)算生長過程中的參數(shù)，是有機(jī)酸發(fā)酵比較常用的碳源。因此，選擇葡萄糖作為碳源。

由圖3b可知，菌株可利用多種氮源，其中有機(jī)氮源如酵母粉、蛋白胨、花生餅粉和尿素的菌體量要高于磷酸氫二銨（DAP）和檸檬酸銨（Atc），且蛋白胨、酵母粉為氮源時(shí)的乳酸產(chǎn)量較高。因此，選擇酵母粉作為氮源。

綜上，選擇葡萄糖和酵母粉作為碳、氮源，用量較大時(shí)選擇工業(yè)葡萄糖和國產(chǎn)酵母粉。

2．2．2 葡萄糖及酵母粉濃度的選擇

培養(yǎng)基中碳、氮源濃度對(duì)菌體生長及產(chǎn)物生成均有較大影響。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源濃度超過5%時(shí)，細(xì)菌會(huì)因細(xì)胞脫水而衰亡，且存在克列勃特里效應(yīng)抑制細(xì)胞的有氧呼吸產(chǎn)能。設(shè)計(jì)葡萄糖及酵母粉濃度梯度實(shí)驗(yàn)考察菌體生長狀況，搖瓶有氧培養(yǎng)16h，測(cè)定吸光度值及菌體干重，結(jié)果見圖4。

由圖4a可知，隨著葡萄糖濃度的增大，菌體量增加；葡萄糖濃度為15g·L－1時(shí)，菌體量最大；當(dāng)葡萄糖濃度超過15g·L－1后，菌體量急劇下降。低葡萄糖濃度（≤15g·L－1）下菌體生長良好，獲得較大積累。但是，過低葡萄糖濃度使得能源供應(yīng)不足，致使菌體量偏小。葡萄糖濃度在10～15g·L－1范圍內(nèi)，阻遏效應(yīng)小，菌體量能夠短期內(nèi)較多積累，因此，選擇最佳葡萄糖濃度為15g·L－1。

由圖4b可知，酵母粉濃度的增大為細(xì)菌提供足量的氮源、氨基酸、生長因子等物質(zhì)，菌體量大幅增加，但高濃度的酵母粉會(huì)致使氮源過飽和，促進(jìn)能量向菌體積累方向轉(zhuǎn)移，反而對(duì)目的產(chǎn)物生成不利。工業(yè)發(fā)酵過程中，往往對(duì)氮源，特別是碳氮比應(yīng)合理掌控，促使能夠獲得更多目的產(chǎn)物。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本、菌體生物量積累等，選擇最佳酵母粉濃度為15g·L－1。

2．2．3 磷酸鹽的選擇

磷是核酸的重要組成成分，參與細(xì)胞的多種代謝，是微生物不可或缺的營養(yǎng)成分。此外，加入磷酸鹽可起到緩沖pH值的效果。按照前述的培養(yǎng)方法，配制含磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀濃度梯度的培養(yǎng)基，搖瓶有氧培養(yǎng)16h，測(cè)定吸光度值及菌體干重，結(jié)果見圖5。

由圖5a可知，隨著K2HPO4·3H2O濃度的增大，菌體量快速增加，K2HPO4·3H2O濃度為2．0g·L－1時(shí)，菌體干重最大，為4．02g·L－1；但過多磷酸鹽的加入會(huì)使得菌體生長變慢，生物量減少。因此，選擇最佳K2HPO4·3H2O濃度為2．0g·L－1。

由圖5b可知，KH2PO4濃度為1．5g·L－1時(shí)，其菌體干重最大，為3．99g·L－1。因此，選擇最佳KH2PO4濃度為1．5g·L－1。

2．2．4 金屬離子鹽的選擇

金屬離子參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成、能量轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性，是微生物正常生長和代謝過程中非常重要的一類元素。細(xì)胞內(nèi)分子成分包括Ca2＋、Mg2＋、Fe2＋，生理調(diào)節(jié)物質(zhì)如Na＋、K＋可以維持細(xì)胞滲透壓，Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋可以作為某些酶的激活劑，特殊分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)如Co2＋、Mo2＋等。因此，考察金屬離子鹽對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長及產(chǎn)物乳酸生成的影響是很有必要的。對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)中常見的金屬離子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)菌體生長的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，Mg2＋、Mn2＋、Fe2＋對(duì)菌體的生長有一定的促進(jìn)作用；Cu2＋、Co2＋有抑制作用；Zn2＋無促進(jìn)或抑制效應(yīng)。因此，進(jìn)一步考察3種金屬離子鹽濃度對(duì)菌體生長和乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。

圖6 金屬離子對(duì)菌體生長的影響Fig．6 Effects of metal ions on cell growth

由圖7a可知，Mg2＋作為乳酸脫氫酶激活劑可以促進(jìn)代謝產(chǎn)物乳酸的生成。在MgSO4·7H2O濃度為1．0g·L－1時(shí)，菌體量和乳酸產(chǎn)量均最大。因此，選擇最佳 MgSO4·7H2O濃度為1．0g·L－1。

由圖7b可知，當(dāng)MnSO4·H2O濃度低于5mg·L－1時(shí)，菌體量及乳酸產(chǎn)量偏低；當(dāng)濃度高于5mg·L－1時(shí)，Mn2＋影響菌體細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)進(jìn)而對(duì)菌體生長及乳酸生成不利。因此，選擇最佳MnSO4·H2O濃度為5mg·L－1。

圖7 金屬離子鹽濃度對(duì)菌體生長及乳酸產(chǎn)量的影響Fig．7 Effects of concentration of metal ion salts on cell growth and lactic acid yield

由圖7c可知，當(dāng)FeSO4·7H2O濃度為30mg·L－1時(shí)，菌體量及乳酸產(chǎn)量均最大；當(dāng)濃度低于或高于30mg·L－1時(shí)，F(xiàn)e2＋對(duì)菌體生長及產(chǎn)物積累有抑制作用。因此，選擇最佳FeSO4·7H2O濃度為30mg·L－1。

2．3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，D－乳酸產(chǎn)量由（13．5±1．29）g·L－1提高至（29．0±1．42）g·L－1，提高一倍以上，光學(xué)純度大于97%。表明通過培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到的是發(fā)酵優(yōu)化初始階段提升產(chǎn)量的較優(yōu)方案，同時(shí)也為發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)、進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝［16］提供了參考和依據(jù)。

3 結(jié)論

采用粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)D－乳酸，考察了培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分對(duì)菌體生長和乳酸產(chǎn)量的影響。確定了最佳培養(yǎng)條件如下：溫度為34℃，pH值為6．5，接種量為5%，載液量為150mL／500mL，采用兩階段培養(yǎng)工藝——前期通氣有氧培養(yǎng)16h、后期厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的培養(yǎng)方案。優(yōu)化的培養(yǎng)基（g·L－1）為：葡萄糖15，酵母粉15，KH2PO41．5，K2HPO4·3H2O 2．0，MgSO4·7H2O 1．0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0．03，MnSO4·7H2O 0．005。在最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，D－乳酸產(chǎn)量由（13．5±1．29）g·L－1提高至（29．0±1．42）g·L－1，產(chǎn)量提高一倍多，光學(xué)純度大于97%。

［1］許婷婷，何冰芳．D－乳酸制備研究進(jìn)展［J］．化工進(jìn)展，2009，28（6）：991－996．

［2］汪新華．乳酸及其衍生物的應(yīng)用與開發(fā)前景［J］．湖北化工，2002，19（1）：42－43．

［3］Wee Y，Kim J，Ryu H．Biotechnological production of lactic acid and its recent applications［J］．Food Technology and Biotechnology，2006，44（2）：163－172．

［4］Miller C，F(xiàn)osmer A，Rush B，et al．Industrial Production of Lactic Acid［M］．Bio－Based Chemicals，2011：179－188．

［5］Shen L，Worrell E，Patel M．Present and future development in plastics from biomass［J］．Biofuels，Bioproducts and Biorefining，2010，4（1）：25－40．

［6］Gao C，Ma C，Xu P．Biotechnological routes based on lactic acid production from biomass［J］．Biotechnol Adv，2011，29（6）：930－939．

［7］Singhvi M，Joshi D，Adsul M，et al．D－（－）－Lactic acid production from cellobiose and cellulose by Lactobacillus lactis mutant Rm2－24［J］．Green Chemistry，2010，12（6）：1106－1109．

［8］John R P，Nampoothiri K M，Pandey A．Fermentative production of lactic acid from biomass：An overview on process developments and future perspectives［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2007，74（3）：524－534．

［9］Okano K，Tanaka T，Ogino C，et al．Biotechnological production of enantiomeric pure lactic acid from renewable resources：Recent achievements，perspectives，and limits［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2010，85（3）：413－423．

［10］代志凱，張翠，阮征．試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化及其在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（6）：694－903．

［11］Rao B，Zhang L Y，Sun J，et al．Characterization and regulation of the 2，3－butanediol pathway in Serratia marcescens［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（5）：2147－2159．

［12］Zhang L，Yang Y，Sun J，et al．Microbial production of 2，3－butanediol by a mutagenized strain of Serratia marcescens H30［J］．Bioresour Technol，2010，101（6）：1961－1967．

［13］Grimont F，Grimont P D．The genus Serratia［J］．Prokaryotes，2006，6：219－244．

［14］Bischoff K M，Liu S，Hughes S R，et al．Fermentation of corn fiber hydrolysate to lactic acid by the moderate thermophile Bacillus coagulans［J］．Biotechnol Lett，2010，32（6）：823－828．

［15］Coelho L F，De Lima C J，Bernardo M P，et al．D－（－）－Lactic acid production by Leuconostoc mesenteroides B512using different carbon and nitrogen sources［J］．Appl Biochem Biotechnol，2011，164（7）：1160－1171．

［16］唐開宇，宋喜軍，高大成，等．乳酸連續(xù)化發(fā)酵進(jìn)展［J］．化學(xué)與生物工程，2006，23（11）：4－6．