響應(yīng)曲面法優(yōu)化刺山柑水溶性多糖提取工藝及其抗氧化性能研究

陳燕勤，陳德軍，張 玲，李 祥

（1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052；2．新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊830046）

刺山柑（Capparis spinosa L．）為白花菜科山柑屬植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤、瓜兒菜或抗旱草，維吾爾語稱“波里克果”或“卡盤”等。刺山柑原產(chǎn)于地中海地區(qū)，現(xiàn)常見于法國南部、意大利和阿爾及利亞等地區(qū)，在我國主要分布于新疆、甘肅、西藏等地的荒漠戈壁和低山坡石質(zhì)沙土地處。刺山柑是維吾爾醫(yī)藥常用藥材，其果實(shí)中含有黃酮、多糖、生物堿以及揮發(fā)性脂肪酸等多類有效成分，具有清除體內(nèi)異常體液、消腫止痛、祛風(fēng)、散寒、除濕、暢通阻滯等功效，臨床主要用于痛風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等骨關(guān)節(jié)疾病的治療。在土耳其、印度及中東地區(qū)，刺山柑作為一種傳統(tǒng)草藥用于滋補(bǔ)、抗炎、降血壓、降血糖、化痰、驅(qū)蟲、利尿、通便等［1－3］。

從天然產(chǎn)物中提取的多糖能參與體內(nèi)細(xì)胞中的各種活動(dòng)，具有重要的特殊生理活性，在提高人體免疫力、抗氧化、抑制癌細(xì)胞、降血糖、抗感染、抗凝血、調(diào)血脂等方面都表現(xiàn)出顯著的藥理作用與藥用功效［4－7］。植物多糖的傳統(tǒng)提取方法為加熱煮沸法，該方法耗時(shí)較長，且有效成分容易損失。超聲波輔助提取植物多糖具有提取效率高、耗時(shí)短、溶劑用量少、活性組分損失小等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到人們的關(guān)注［8－10］，但關(guān)于刺山柑水溶性多糖的超聲提取研究鮮有報(bào)道。

作者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)曲面法對(duì)刺山柑水溶性多糖的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)考察提取的刺山柑水溶性多糖的抗氧化性能，擬為刺山柑的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 材料、試劑與儀器

刺山柑（Capparis spinosa L．）果實(shí)，產(chǎn)自新疆吐魯番。

無水乙醇、丙酮、乙醚，天津市化學(xué)試劑三廠；石油醚（沸程60～90℃）、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、過氧化氫，天津福晨化學(xué)試劑廠；苯酚、濃硫酸，天津科盟化工工貿(mào)有限公司；葡萄糖，上海山浦化工有限公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯三酚，天津光復(fù)化學(xué)研究所。所用試劑均為分析純。

TU1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司；KQ－400KDE型超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；DHG－9101A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 預(yù)處理

將制干刺山柑果實(shí)用重物碾碎過篩（10＃篩，方孔2．0mm），用濾紙包住，放入索氏提取器中，用電熱套加熱回流，先用95%乙醇回流至無色，再用石油醚回流3h，除去色素及脂類物質(zhì)，然后將刺山柑粉末烘干備用。

1．2．2 刺山柑水溶性多糖超聲輔助提取工藝

流程：刺山柑粉末→蒸餾水超聲提取→過濾→離心→減壓濃縮→去蛋白→離心→洗滌沉淀→干燥→粗多糖。

具體操作：取經(jīng)過預(yù)處理的刺山柑粉末4．0g，加入100mL蒸餾水，在80℃超聲輔助提取85min，合并濾液減壓濃縮至適當(dāng)體積，用Sevage法除去蛋白質(zhì)，離心，取上清液減壓濃縮，得刺山柑水溶性多糖糖漿，依次用乙醇、乙醚、丙酮淋洗，真空干燥，得刺山柑水溶性粗多糖。

1．2．3 刺山柑水溶性多糖含量及提取率的測定

多糖含量的測定采用苯酚－硫酸法［11］。準(zhǔn)確移取一定濃度刺山柑水溶性粗多糖溶液1mL，分別加入1mL 6%苯酚和5mL濃硫酸，沸水浴5min后立即冷卻，在波長495nm處測定吸光度。以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y＝0．0726x＋0．1321（R2＝0．9911），據(jù)此測得刺山柑水溶性多糖的含量，依下式計(jì)算提取率：

1．2．4 刺山柑水溶性多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在保持其它條件不變的情況下，分別考察提取溫度、提取時(shí)間和液料比［V（蒸餾水）∶m（刺山柑粉末），mL∶g，下同］3個(gè)因素對(duì)刺山柑水溶性多糖提取率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)的因素與水平如表1所示。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素和水平Tab．1Factors and levels of single factor experiment

1．2．5 刺山柑水溶性多糖提取的響應(yīng)曲面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取提取溫度（℃）、提取時(shí)間（min）、液料比（mL∶g）為影響因素，應(yīng)用Box－Behnken的中心組合方法設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)。利用 Design Expert 7．1．6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。Box－Behnken實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表2。

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平Tab．2Factors and levels of Box－Behnken experiment

1．2．6 刺山柑水溶性多糖抗氧化性能研究

1．2．6．1 對(duì)羥基自由基（·OH）清除作用的測定

在試管中依次加入0．5mL 9mmol·L－1水楊酸－乙醇溶液、9mmol·L－1Fe2＋溶液（現(xiàn)配）、0．5mL不同濃度的待測樣品和3．5mL蒸餾水，最后加入5 mL 8．8mmol·L－1H2O2使體系發(fā)生 Fenton反應(yīng)，反應(yīng)一定時(shí)間后搖勻，在波長510nm處測定吸光度A1。重復(fù)測定3次，取平均值。多糖樣品對(duì)羥基自由基的清除率（K）按下式計(jì)算：

式中：A1為加入Fe2＋溶液的吸光度；A2為加入蒸餾水代替Fe2＋溶液的吸光度；A3為加入蒸餾水代替待測樣品的吸光度。

1．2．6．2 對(duì)超氧陰離子自由基（·O－2）清除作用的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定。取100μL不同濃度的待測樣品與4．5mL 10mmol·L－1PBS緩沖溶液（pH值8．3）混合，將混合液在25℃下恒溫15min，取出3mL加入到100μL 45mmol·L－1鄰苯三酚溶液中，反復(fù)振蕩3min后，在波長420nm處測定吸光度A′1。重復(fù)測定3次，取平均值。多糖樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率（K′）按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2．1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2．1．1 提取溫度對(duì)刺山柑水溶性多糖提取率的影響（圖1）

BOTDR是布里淵散射光時(shí)域反射測量技術(shù)(Brillouin Optical Time Domain Reflectometry)的縮寫，是一種分布式應(yīng)變監(jiān)測技術(shù)，屬于滑坡地表位移測線型監(jiān)測技術(shù)。其基本原理是利用光纖中的自然布里淵散射光的頻移變化量與光纖所受的軸向應(yīng)變和溫度的線性關(guān)系，得到光纖的軸向應(yīng)變，進(jìn)而求出軸向位移[21]，根據(jù)BOTDR接收到的布里淵散射光頻率，即可完成光纖上各點(diǎn)的定位和測量。布里淵散射光頻率的漂移量與光纖的軸向應(yīng)變和溫度的關(guān)系與可用下式表示：

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig．1 Effect of extraction temperature on polysaccharides extraction rate

由圖1可以看出，刺山柑水溶性多糖提取率隨提取溫度的升高逐漸上升，這是由于溫度升高使得多糖分子的動(dòng)能增加、擴(kuò)散作用加強(qiáng)，提取率上升；當(dāng)溫度為80℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值；隨著溫度的繼續(xù)升高，提取率有下降趨勢，這可能是由于高溫對(duì)水溶性多糖的結(jié)構(gòu)和活性有影響，使得水溶性多糖加速降解，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，在響應(yīng)曲面法的中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇70℃、80℃和90℃作為提取溫度的3個(gè)水平參數(shù)。

2．1．2 提取時(shí)間對(duì)刺山柑水溶性多糖提取率的影響（圖2）

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig．2 Effect of extraction time on polysaccharides extraction rate

由圖2可以看出，刺山柑水溶性多糖提取率隨提取時(shí)間的延長逐漸上升，在提取85min之后升幅趨緩，可能是由于提取一定時(shí)間后溶液體系滲透壓趨于平衡所致。因此，在響應(yīng)曲面法的中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇80min、85min和90min作為提取時(shí)間的3個(gè)水平參數(shù)。

2．1．3 液料比對(duì)刺山柑水溶性多糖提取率的影響（圖3）

由圖3可以看出，刺山柑水溶性多糖提取率隨液料比的增大逐漸上升，這主要是因?yàn)樵黾铀渴沟枚嗵堑娜艹雎试龃?；?dāng)液料比達(dá)25∶1之后，由于溶液體系滲透壓趨于平衡，提取率基本保持不變。因此，在響應(yīng)曲面法的中心組合實(shí)驗(yàn)中選擇20∶1、25∶1和30∶1作為液料比的3個(gè)水平參數(shù)。

圖3 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig．3 Effect of liquid－solid ratio on polysaccharides extraction rate

2．2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2．2．1 模型方程的建立及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box－Behnken中心組合法，設(shè)計(jì)刺山柑水溶性多糖的超聲輔助提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)［12］。通過最小二乘法擬合出該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷亩味囗?xiàng)式方程：

式中：R1為預(yù)測響應(yīng)值（刺山柑水溶性多糖提取率）；β0為常數(shù)項(xiàng)；βi為線性系數(shù)；βii為二次項(xiàng)系數(shù)；βij為交互項(xiàng)系數(shù)；xi、xj（i≠j）為自變量編碼值。

表3 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab．3Design and result of Box－Behnken experiment

2．2．2 模型的顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)方程（1），采用 Design Expert 7．1．6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬回歸分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。對(duì)該回歸模型系數(shù)顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表4回歸模型的方差分析Tab．4 Variance analysis of regression model

由表4可以看出，該實(shí)驗(yàn)所選模型的P值小于0．0001，說明模型的顯著性為極其顯著，符合實(shí)驗(yàn)的要求。模型失擬項(xiàng)的P值為0．7619，顯著性判定為沒有顯著性意義，說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中沒有異常實(shí)驗(yàn)，模型的回歸方程不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)。模型校正后的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0．9798，表明模型的響應(yīng)值（多糖提取率）中97．98%的變化來自于所選變量，實(shí)驗(yàn)變量的選擇在響應(yīng)值影響的范圍內(nèi)。方差分析表明模型與實(shí)驗(yàn)的擬合情況較好，可以用于分析和預(yù)測刺山柑水溶性多糖超聲輔助提取工藝的優(yōu)化［13］。

由表5可以看出，模型的一次項(xiàng)A、B、C的P值均小于0．01，說明實(shí)驗(yàn)選擇的影響因素的3個(gè)水平對(duì)刺山柑水溶性多糖提取率的影響顯著，即實(shí)驗(yàn)選擇的條件范圍符合刺山柑水溶性多糖提取工藝條件選擇的需要。模型的二次項(xiàng)A2、C2的P值小于0．01，說明提取溫度和液料比對(duì)多糖提取率的影響較為顯著，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。對(duì)于模型的交互項(xiàng)來說，BC的P值小于0．05，說明提取時(shí)間和液料比之間有一定的交互作用，在選擇刺山柑水溶性多糖的提取工藝條件時(shí)要考慮兩者之間的關(guān)系。

通過上述分析，對(duì)模型中影響不夠顯著的項(xiàng)進(jìn)行優(yōu)化，得到修正后的刺山柑水溶性多糖提取率（R1）對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和液料比（C）的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

2．2．3 響應(yīng)面分析

根據(jù)模型的二次多項(xiàng)式回歸方程，繪制相應(yīng)的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，以考察相應(yīng)因素之間對(duì)于結(jié)果的交互影響程度的強(qiáng)弱。R1＝f（A，B，C＝25∶1）的響應(yīng)面及等高線見圖4，R1＝f（A，C，B＝85min）的響應(yīng)面及等高線見圖5，R1＝f（B，C，A＝80℃）的響應(yīng)面及等高線見圖6。

在等高線圖中，等高線的形狀可以反映兩種因素對(duì)于結(jié)果的交互效應(yīng)的影響，橢圓形表示兩因素交互影響顯著，圓形則相反。由圖4和圖5可以看出，其等高線曲線接近圓形，說明相對(duì)應(yīng)的因素提取溫度與提取時(shí)間、提取溫度與液料比之間的交互作用不夠顯著，為較獨(dú)立的影響因素。而由圖6可以看出，其等高線曲線接近橢圓形，說明提取時(shí)間和液料比兩因素之間交互作用較為顯著，這與回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果相吻合。

綜合回歸模型和響應(yīng)面分析結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)刺山柑水溶性多糖提取率的影響程度依次為：液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間，其中液料比、提取溫度對(duì)提取率影響較大，而提取時(shí)間的影響較小。

2．2．4 刺山柑水溶性多糖提取工藝條件模型計(jì)算

利用修正后的回歸模型計(jì)算得到刺山柑水溶性多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度85．74℃，提取時(shí)間88．95min，液料比30∶1，預(yù)測最高多糖提取率為8．98%。

2．2．5 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)曲面法模型的可靠性，在模型計(jì)算得到的優(yōu)化工藝條件下提取刺山柑水溶性多糖，分別進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，刺山柑水溶性多糖的提取率分別為8．92%、8．85%、8．89%，平均值為8．89%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算結(jié)果吻合較好，表明該模型對(duì)刺山柑水溶性多糖的提取具有良好的預(yù)測性。因此，確定基于響應(yīng)曲面法優(yōu)化的刺山柑水溶性多糖超聲輔助提取工藝條件為：提取溫度85℃，提取時(shí)間89min，液料比30∶1。

2．3 刺山柑水溶性多糖的抗氧化性能

對(duì)提取得到的刺山柑水溶性多糖粗提物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·）的清除能力，結(jié)果見圖7。

圖7 多糖對(duì)羥基自由基（a）和超氧陰離子自由基（b）的清除能力Fig．7 Capability to scavenge hydroxyl free radical（a）and superoxide anion free radical（b）of polysaccharides

由圖7可以看出，刺山柑水溶性多糖對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O）均有一定的清除作用。隨著濃度的增大，刺山柑水溶性多糖對(duì)兩種自由基的清除能力明顯升高，當(dāng)添加濃度為4mg·mL－1時(shí)，刺山柑水溶性多糖對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O）的清除率均達(dá)到較高水平，分別為67．38%和41．12%。表明，刺山柑水溶性多糖具有一定的抗氧化活性。

3 結(jié)論

（1）在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用 Box－Behnken設(shè)計(jì)、響應(yīng)曲面法以及 Design Expert 7．1．6 軟件，建立了以刺山柑水溶性多糖提取率為響應(yīng)值，以提取溫度、提取時(shí)間、液料比為影響因子的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。根據(jù)模型以及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)最終確定超聲輔助提取刺山柑水溶性多糖的優(yōu)化工藝條件為：提取溫度85℃、提取時(shí)間89min、液料比30∶1（mL∶g），在此條件下平均提取率為8．89%。

（2）采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的刺山柑水溶性多糖提取工藝科學(xué)合理，與實(shí)際結(jié)果吻合較好，為刺山柑水溶性多糖的提取提供了理論依據(jù)。

（3）抗氧化活性研究結(jié)果表明，刺山柑水溶性多糖對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O－2）具有一定的清除作用，說明刺山柑水溶性多糖是一種有潛在開發(fā)價(jià)值的天然抗氧化劑。

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