海洋細菌抗菌篩選及深海獨島枝芽胞桿菌A493活性物質分離鑒定

張少博，邵宗澤，黃 典，陳 莉，喻子牛，張吉斌

（1．華中農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，微生物農(nóng)藥國家工程研究中心，湖北 武漢430070；2．國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門361005）

最近幾十年間人們從海洋微生物中分離得到了許多生物活性物質，極大地擴展了新型活性物質的來源。Hotta等［1］從日本海微生物中分離到菌株Streptomyces tenjimariensis SS－939，并從其發(fā)酵液中分離提純得到2種氨基糖苷類抗生素Istamysin A和B；Imamura等［2］從海洋微生物中分離到一種細菌新屬Pelagiobacter variabilis，能產(chǎn)生新型吩嗪類抗生素Pelagiomicins A、B和 C；Tuin等［3］從海洋芽胞桿菌中分離得到了Ioloatin C的同系物；田黎等［4］從東海大陸架、渤海等地篩選得到幾株海洋芽胞桿菌，其代謝產(chǎn)生的抗菌蛋白對病原真菌具有強烈的抑制作用。

相對于陸地微生物，海洋微生物生活在非常特殊的環(huán)境中，其代謝產(chǎn)物的多樣性和代謝途徑的獨特性決定了海洋微生物次級代謝產(chǎn)物具有新穎的結構和特異的生物活性。生活環(huán)境特殊、種類復雜等特點賦予海洋微生物更好的抗菌活性和產(chǎn)生更多新型抗菌活性物質的能力［5］。

作者在此從海洋微生物中篩選得到具有抗植物病原菌作用的菌株——深海獨島枝芽胞桿菌A493（Virgibacillus dokdonensis A493），對其進行抗菌活性物質的分離鑒定研究。

1 實驗

1．1 病原指示菌與海洋菌株

（1）拮抗細菌指示菌：水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae）、青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum）、野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv．campestris）、胡 蘿卜軟腐歐文氏 菌（Erwinia carotovora subsp．Carotovora Bergey et al．）、埃希氏桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、惡 臭 假 單 胞 菌 KT2440（Pseudomonas putida KT2440）、熒 光 假 單 胞 菌SBW25（Pseudomonas fluorescens SBW25）、熒光假單胞菌Pf0－1（Pseudomonas fluorescens Pf0－1）、丁香假單胞 菌 DC3000（Pseudomonas syringae pv．tomato DC3000）、黃色海假單胞菌（Pseudomonas xanthomarina）、淺黃色假單胞菌（Pseudomonas flavescens）、鹽單胞菌（Halomonas sp．），其中惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌由美國農(nóng)業(yè)部根病生物防治實驗室Weller教授提供；丁香假單胞菌DC3000由南京農(nóng)業(yè)大學郭堅華教授提供；其余菌株由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室菌種保藏中心（CCAM）提供。

（2）農(nóng)作物病原真菌指示菌：意大利青霉（Penicillium italicum Wehmer）、稻 梨 孢 菌 （Pyricularia oryzae Cav．）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Huhn．）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf．sp．Vasinfectum）、核盤菌［Sclerotinia sclerotiorum（Lib．）de Bary］、奇異長喙殼菌［Ceratocystis paradoxa （Dade）Mereau］、玉蜀黍赤霉［Gibberella zeae （Schw．）］、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers．）、玉蜀黍平臍蠕孢菌［Bipolaris maydis （Nisikado et Miyake）Shoeml］、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae），以上菌株由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室菌種保藏中心（CCAM）提供。

（3）海洋菌株共計411株，由中國海洋微生物菌種保藏管理中心（MCCC）提供。國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室鑒定并提供深海獨島枝芽胞桿菌（Virgibacillus dokdonensis）A493（MCCC 1A00493）。該菌分離自東太平洋多金屬結核區(qū)，采集深度4754m，站點：ES0304。

1．2 培養(yǎng)基

（1）海洋細菌培養(yǎng)基（2216e）：蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉浸粉1g，乙酸鈉1g，硝酸銨0．2g，檸檬酸鈉0．5g，檸檬酸鐵0．1g，人工海水定容至1L，pH 值7．6±0．2。

人工海水配方：氯化鈉19．45g，氯化鎂0．75g，硫酸鎂0．75g，氯化鈣1g，氯化鉀0．55g，碳酸氫鈉0．16g，溴化鉀0．08g，氯化鍶34mg，硼酸22mg，硅酸鈉4mg，氟化鈉2．4mg，磷酸氫二鈉8mg，氯化錳0．5 mg，硫酸銅0．5mg，硫酸鋅10mg，純水定容至1L。

（2）植物病原菌培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1L。

（3）細菌培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸餾水1L。

（4）水稻黃單胞菌培養(yǎng)基（協(xié)本氏培養(yǎng)基）：馬鈴薯300g，蔗糖15g，十二水合磷酸氫二鈉2g，四水合硝酸鈣0．5g，蛋白胨5．0g，蒸餾水1L。

以上均為液體培養(yǎng)基，加1．5%瓊脂粉配制相應固體培養(yǎng)基。

1．3 方法

1．3．1 海洋拮抗細菌篩選

1．3．1．1 植物病原菌培養(yǎng)方法

以水稻黃單胞菌、意大利青霉、稻梨孢菌、灰葡萄孢菌、玉蜀黍平臍蠕孢菌、大麗輪枝菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌等7種植物病原菌為指示菌。水稻黃單胞菌采用協(xié)本氏液體培養(yǎng)基制作菌懸液，其它病原菌采用接瓊脂菌塊法接入帶有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)基中制作菌懸液。

1．3．1．2 海洋細菌培養(yǎng)方法

采用2216e標準培養(yǎng)基，250mL錐形瓶中裝液量為50mL，培養(yǎng)時間為48h，培養(yǎng)溫度為28℃（個別嗜熱細菌采用60℃）。

1．3．1．3 拮抗菌株初篩

采用打孔平板對峙法。吸取100μL水稻黃單胞菌等懸液，均勻涂布相應固體瓊脂培養(yǎng)基平板，然后在培養(yǎng)基上用5mm直徑打孔器均勻打孔6個，挑出瓊脂塊備用。精確吸取不同海洋細菌發(fā)酵液50μL，分別加入到瓊脂平板已經(jīng)制備好的孔中，觀察抑制效果。病原細菌培養(yǎng)24h、病原真菌培養(yǎng)48h，每株菌液3組重復。

1．3．1．4 拮抗菌株復篩

將初篩得到的潛在拮抗菌株的發(fā)酵液于4℃、8000r·min－1離心30min去除菌體后，再用0．22μm細菌過濾器徹底去除菌體，然后采用打孔平板對峙法進行復篩。每組重復3次。

1．3．1．5 抗菌譜測定

對復篩得到的菌株進行抗菌譜測試，抗菌測試針對數(shù)十種植物病原細菌和真菌進行，以期發(fā)現(xiàn)具有特異抗菌譜的活性物質。具體測試采用牛津杯法：吸取100μL水稻黃單胞菌等懸液，均勻涂布相應固體瓊脂培養(yǎng)基平板，待涂抹均勻晾干后取2個滅菌牛津杯對稱放入平皿中，一個加入100μL無菌水作為對照，另外一個加入100μL溫度處理后的無菌發(fā)酵上清液。每組重復3次。

1．3．2 A493溫室生防實驗

1．3．2．1 水稻栽培

水稻種子先用75%乙醇浸泡30s，然后用1%升汞處理15min，最后用無菌水清洗3次。在滅菌的玻璃平皿中鋪上一層滅菌濾紙，將處理好的水稻種子整齊地放置在上面，28℃保持濕潤。待水稻種子發(fā)芽后轉入直徑20cm的裝有4000g滅菌土的盆中，每盆栽種6株。

1．3．2．2 病原菌及生防樣品制備

將水稻黃單胞菌采用協(xié)本氏液體培養(yǎng)基活化后，離心取菌體沉淀，無菌水稀釋至終濃度為108CFU·mL－1。

A493在優(yōu)化條件下，發(fā)酵成熟后，離心除菌取上清液，即得A493樣品，備用。

1．3．2．3 溫室實驗

采用剪葉片法接種病原菌。待水稻生長到第5片葉片時用蘸有菌液的滅菌剪刀剪去第5片葉尖1cm長度來接種水稻黃單胞菌。接種病原菌后第2d噴灑A493樣品1次（每盆噴灑15mL），20d后觀察實驗情況。實驗分為3組：（1）不接水稻黃單胞菌噴灑清水處理；（2）接水稻黃單胞菌噴灑清水處理；（3）接水稻黃單胞菌噴灑A493樣品處理。每組3盆重復，共9盆，每盆6株水稻。

通過比較病斑面積（L）和葉片總面積（W）來評價防治效果［6］。依據(jù)L／W值將病情分級：0級表示葉片沒有受到侵染；1級，L／W＜0．2；3級，L／W＝0．25；5級，L／W＝0．5；7級，L／W＝0．75；9級表示整片葉片枯死。

1．3．3 A493產(chǎn)活性物質的分離純化和鑒定

1．3．3．1 發(fā)酵液的制備

將保存于甘油管的A493劃線平板活化，挑取單菌落接種于裝有50mL 2216e培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，28℃、180r·min－1培養(yǎng)12h作為種子液；按照1%接種量接入發(fā)酵搖瓶中，28℃、180r·min－1培養(yǎng)48h，收集發(fā)酵液，待用。

1．3．3．2 活性物質提取

取1L發(fā)酵液8000r·min－1離心30min去除菌體，上清液與等體積甲醇混合，4℃沉淀過夜，再于8000r·min－1離心30min去除沉淀；上清液于60℃真空旋轉蒸發(fā)蒸干，析出的固體物質用甲醇溶解，去除不溶的小分子鹽類；最后用氮氣吹干，得到活性粗提物，備用。

1．3．3．3 離子交換法分離

第一步：采用CM－52型弱酸性陽離子交換纖維素分離。CM－52陽離子交換填料用pH值8．0的0．2 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液活化處理過夜，再經(jīng)過脫氣處理后裝柱（1．6cm×70cm），用pH 值8．0的0．02 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液平衡過夜；活性粗提物用pH值8．0的0．02mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液溶解上樣，流速0．6mL·min－1，用核酸蛋白檢測儀于220 nm紫外波長下檢測并根據(jù)峰圖收集活性部分。分別檢測每一個峰的活性，重復3次。

第二步：采用DEAE－52型弱堿性陰離子交換纖維素分離。DEAE－52陰離子交換填料用pH值6．0的0．2mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液活化，經(jīng)過脫氣處理后裝柱（1．6cm×70cm），用pH 值6．0的0．02mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液平衡過夜；將CM－52收集到的活性部分60℃真空旋轉蒸發(fā)至干后，用pH值6．0的0．02mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液溶解上樣，流速0．6 mL·min－1，用核酸蛋白檢測儀于220nm紫外波長下檢測并根據(jù)峰圖收集活性部分。分別檢測每一個峰的活性，重復3次。

1．3．3．4 薄層層析分離

第一次分離：展開液采用甲醇∶氯仿∶濃氨水 ＝4∶2．2∶3．2，加入層析缸后預飽和30min。點樣位置距離硅膠板下層1cm處，展開劑展開3h，通過0．3%水合茚三酮（0．3g茚三酮，97mL正丁醇，3mL乙酸）顯色得到分離的各個條帶。經(jīng)過大量點板收集條帶，分別切膠后用甲醇溶解回收，然后用氮氣吹干甲醇，用水溶解，測試活性。每組實驗重復3次。

第二次分離：將第一次分離得到的活性條帶濃縮制樣。展開液采用正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶1，加入層析缸后預飽和30min。點樣位置距離硅膠板下層1cm處，展開劑展開7h，通過0．3%水合茚三酮顯色得到分離的各個條帶。經(jīng)過大量點板收集條帶，分別切膠后用甲醇溶解回收，然后用氮氣吹干甲醇，用水溶解，測試活性。每組實驗重復3次。

1．3．3．5 苯磺酸型固相萃取柱凈化

將Supelclean LC－SAX型固相萃取小柱先后用5mL甲醇和5mL水清洗，然后用20mL 0．03mol·L－1鹽酸溶液活化；樣品溶液用鹽酸調(diào)pH值為4．0上樣，待樣品溶液自然降落完全后，抽干小柱內(nèi)液體，用5 mL pH值4．0的鹽酸水溶液洗脫后抽干小柱，然后用30mL pH值7．0的純水洗脫，最后用5mL含5%氨水的甲醇溶液洗脫。分別收集樣品，真空旋轉蒸發(fā)，待用。

1．3．3．6 活性物質的Doskochilova系統(tǒng)紙層析

采用Doskochilova溶劑系統(tǒng)：

（1）用水飽和的正丁醇；

（2）用水飽和的正丁醇，內(nèi)含2%對甲基苯磺酸；（3）正丁醇∶醋酸∶水＝2∶1∶1；

（4）用水飽和的正丁醇，內(nèi)含2%六氫吡啶；

（5）pH 值7．0的0．5mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液，用正丁醇飽和；

（6）用正丁醇飽和的水，內(nèi)含2%對甲基苯磺酸；

（7）苯∶甲醇＝4∶1，濾紙用pH 值7．0的0．5 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液處理；

（8）75%甲醇，25%水（內(nèi)含3%NaCl），濾紙用5%硫酸鈉處理。

取樣品10μL點至距濾紙條（1cm×20cm）下端1cm處，在密閉的層析缸（35cm×15cm×20cm）中上行擴展，溶劑擴展18cm后停止層析。溶劑10mL，濾紙使用前先用展開劑飽和30min。

采用生物顯影法測試抑菌位置［7，8］：待培養(yǎng)基自然冷卻至50℃左右時，加入水稻黃單胞菌混合均勻倒平板。待平板吹干后將晾干的層析紙條貼于平板上，置于4℃冰箱2h后將層析紙揭下。最后在28℃的恒溫箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察并測定Rf值。

1．3．3．7 ESI－MSn分析

通過自動進樣器吸入10μL樣品，然后用C18柱進行反相色譜分離，流動相為乙腈的10%水溶液，流速為300μL·min－1。質譜條件：電噴霧ESI離子源，正離子模式檢測；離子源噴射電壓4．50kV；毛細管溫度250℃；氮氣流速1．0L·min－1；碰撞氣體 He；碰撞能量25eV；檢測方式為一級全掃描和多級全掃描。

檢測方法：用雙蒸水溶解精制樣品，導入ESI離子源，先用一級全掃描質譜方式獲得樣品的準分子離子峰［M＋H］＋峰，然后選擇準分子離子峰及碎片峰進行ESI－MSn分析，獲得樣品的多級質譜圖。

2 結果與討論

2．1 篩選結果

2．1．1 初篩結果

通過以水稻黃單胞菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、大麗輪枝菌、意大利青霉、稻梨孢菌、灰葡萄孢菌、玉蜀黍平臍蠕孢菌等7種植物病原菌為指示菌進行初篩，獲得發(fā)酵液具有抗性的海洋菌株共81株，占篩選的海洋細菌總數(shù)的19．7%。

對各病原菌的抗性菌株數(shù)量進行了統(tǒng)計，結果見表1。

表1 發(fā)酵液初篩結果Tab．1 Initial screening of fermentation broth

由表1可知，411株海洋細菌中對玉蜀黍平臍蠕孢菌具有抗性的菌株較多，篩得率為12．2%；而對意大利青霉具有抗性的菌株較少，篩得率為6．2%；其它菌的抗性菌株篩得率在8．3%～9．9%之間。

2．1．2 復篩結果

復篩結果顯示，只有7株海洋細菌的無菌發(fā)酵上清液還表現(xiàn)出抑菌活性，占篩選總數(shù)的1．7%，這說明大部分抗性菌株可能是通過營養(yǎng)競爭、活性物質含量過低、持續(xù)性分泌不穩(wěn)定活性物質等方法來達到抗菌目的；且411株海洋細菌無菌發(fā)酵上清液對大麗輪枝菌、意大利青霉、灰葡萄孢菌均無活性。7株海洋細菌中：A018是海洋死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）、A019、A142、A206是海洋枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、A178是海洋Lysinibacillus屬細菌（Lysinibacillus sp．）、A397是海洋莫哈韋芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）、A493是海洋獨島枝芽胞桿菌（Virgibacillus dokdonensis）。它們的抑菌效果見表2。

表2 7株復篩菌的無菌發(fā)酵上清液的抑菌效果Tab．2 The antibacterial efficiency of aseptic fermentation supernatants of the seven strains rescreened

2．1．3 抗菌譜測定

抗菌譜測定實驗從7株復篩菌中發(fā)現(xiàn)了一株抗菌譜特異的菌株A493（MCCC 1A00493）。菌株A493無菌發(fā)酵上清液的抑菌效果見圖1。

由圖1可知，菌株A493對陸地來源水稻黃單胞菌抑制效果最好，對海洋來源淺黃色假單胞菌和鹽單胞菌也具有一定的抗性。

測定A493對病原細菌和病原真菌的抗菌譜，見表3。

圖1 菌株A493無菌發(fā)酵上清液抑菌效果Fig．1 The antibacterial efficiency of aseptic fermentation supernatant of V．dokdonensis A493

表3 A493對指示病原細菌和真菌的抗菌譜測定Tab．3 The spectrum assay of V．dokdonensis A493against indicating pathogenic bacteria and fungi

由表3可知，A493產(chǎn)活性抗菌物質對陸地來源水稻黃單胞菌和野油菜黃單胞菌的抗性較強，對海洋來源黃色海假單胞菌、淺黃色假單胞菌和鹽單胞菌具有一定的抗性；對胡蘿卜軟腐歐文氏菌、埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、丁香假單胞菌和惡臭假單胞菌無抗性。由表3還可知，A493產(chǎn)活性抗菌物質對所測試的真菌均無抗性。表明A493是一種窄譜的拮抗菌，其抗菌譜具有特異性。

2．2 溫室生防實驗結果

菌株A493對水稻白葉枯病害的生防效果見表4。

表4 菌株A493對水稻白葉枯病害的生防效果Tab．4 The biocontrol effect of V．dokdonensis A493to rice bacterial blight

由表4可知，水稻生長20d后A493無菌發(fā)酵上清液對水稻白葉枯病害防治效果達到了66．7%；接病原菌對照100%發(fā)??；不接病原菌對照生長良好。

2．3 A493產(chǎn)活性物質的分離純化和鑒定

2．3．1 陽離子交換法分離結果

經(jīng)過前處理的樣品先通過纖維素型陽離子交換填料CM－52提純，結果見圖2。

圖2 A493產(chǎn)活性物質陽離子交換色譜Fig．2 Cation exchange chromatogram of active substance fromV．dokdonensis A493

由圖2可看出，220nm紫外檢測波長下共有5個峰出現(xiàn)，分別收集，真空旋轉蒸發(fā)濃縮后測試其對水稻黃單胞菌的抑制活性。結果顯示只有最早出現(xiàn)的A峰物質具有抑菌效果。

2．3．2 陰離子交換法分離結果（圖3）

圖3 A493產(chǎn)活性物質陰離子交換色譜Fig．3 Anion exchange chromatogram of active substance fromV．dokdonensis A493

由圖3可知，220nm紫外檢測波長下共有2個峰出現(xiàn)，分別收集，真空旋轉蒸發(fā)濃縮后測試其對水稻黃單胞菌的抑制活性。結果顯示只有B峰物質具有抑菌效果。

2．3．3 薄層層析分離結果

將離子交換法分離收集的活性樣品旋轉蒸發(fā)干燥，用一定量甲醇溶液溶解，按1．3．3．4方法進行薄層層析。

第一次分離結果顯示，有4條主要條帶（圖4A），測試抑菌活性發(fā)現(xiàn)，只有條帶d具有活性，Rf值＝0．71。

再將有活性的條帶d濃縮制樣進行第二次分離。結果顯示有4條主要條帶（圖4B），測試抑菌活性發(fā)現(xiàn)，只有條帶I具有活性，Rf值＝0．14。

圖4 活性物質的薄層層析圖譜Fig．4 TLC Chromatograms of active substance

2．3．4 苯磺酸型固相萃取柱凈化結果

分別將各洗脫溶液旋轉蒸發(fā)后用水溶解，測試活性。結果顯示，用30mL pH值7．0的純水就可以將活性物質完全洗脫，進一步去除了雜質。

2．3．5 活性物質的Doskochilova系統(tǒng)紙層析結果

按照Doskochilova系統(tǒng)方法進行紙層析，通過生物顯影法，測定抗菌活性物質在8種溶劑系統(tǒng)中的展開距離，計算Rf值。以溶劑系統(tǒng)的序號為橫坐標、Rf值為縱坐標繪制紙層析圖譜，并與12種抗生素標準品進行對比，結果見圖5。

圖5 抗生素標準品紙層析圖譜（A）和抗菌活性物質紙層析圖譜（B）Fig．5 Illustrations of antibiotic standards（A）and antibacterial active substance（B）paper chromatograms

由圖5可看出，A493產(chǎn)生的抗菌活性物質與鏈霉 素的紙層析圖譜（圖5A中圈中部分）最為相似，結合其強極性且可以被水合茚三酮染色顯淡黃色的性質，初步推斷為氨基糖苷類抗生素。

2．3．5 電噴霧質譜結果（圖6）

圖6 樣品的ESI－MSn質譜圖Fig．6 ESI－MSn Patterns of sample

由圖6可看出，在一級全掃描的情況下，獲得了樣品的［M＋H］＋離子峰m／z317．9；二級質譜分析顯示脫下一個大片段的基團，生成m／z 112．8的準分子離子峰；對這個二級碎片進行三級質譜分析，得到了m／z 69．1的準分子離子峰。初步判斷活性物質分子量為317Da。

2．4 討論

以多種植物病原菌為指示菌，對411株海洋菌株進行了抗菌篩選。通過對水稻黃單胞菌等植物病原菌進行篩選，初篩獲得具有抗性的海洋菌株共81株，占篩選的海洋細菌總數(shù)的19．7%；復篩獲得具有抗性的海洋菌株只有7株，占篩選總數(shù)的1．7%。造成這種結果的原因可能是由于菌株的營養(yǎng)競爭、持續(xù)性分泌不穩(wěn)定抗菌活性物質、活性物質含量過低等因素導致的。

通過高通量篩選獲得一株分離自東太平洋深海多金屬結核區(qū)的深海獨島枝芽胞桿菌（V．dokdonensis）A493。無菌發(fā)酵上清液抗菌譜測定顯示其對陸地來源水稻黃單胞菌、野油菜黃單胞菌以及一些海洋來源黃色海假單胞菌、淺黃色假單胞菌、鹽單胞菌具有抗性；對胡蘿卜軟腐歐文氏菌、埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、丁香假單胞菌和惡臭假單胞菌以及測試的真菌均無抗性。表明其具有特異的抗菌譜。通過陰、陽離子交換色譜法粗提取、2次薄層層析硅膠板回收分離，得到純化活性物質，經(jīng)過ESI－MSn分析，分子量大小為317Da。

本研究通過Doskochilova系統(tǒng)紙層析分析，結果顯示活性物質為氨基糖苷類物質，一般的氨基糖苷類抗生素，例如慶大霉素、卡那霉素、核糖霉素、新霉素、巴龍霉素、鏈霉素等分子量均大于400Da［9，10］。通過分析對比活性物質與該類物質標準品的紙層析譜圖，結果發(fā)現(xiàn)A493產(chǎn)生的抗菌活性物質與鏈霉素的紙層析圖譜最為相似。

大觀霉素分子量為332Da，是比較特殊的氨基糖苷類抗生素，結構中的糖環(huán)不是通過C－O鍵相連，而是環(huán)環(huán)相扣，所以其裂解途徑與該類化合物明顯不同。大觀霉素在正離子模式下MS裂解二級質譜生成m／z 189的碎片離子，三級質譜生成m／z 158的碎片離子，還可以脫水生成m／z140的碎片離子［11］，質譜裂解產(chǎn)生的碎片峰較少，表明大觀霉素環(huán)環(huán)相扣的結構比較穩(wěn)定。

本實驗得到的活性物質與大觀霉素分子量相差15Da，電噴霧質譜結果也顯示其具有較穩(wěn)定的母核結構，推測其可能具有與大觀霉素類似的環(huán)環(huán)相扣的穩(wěn)定結構。但是大觀霉素是一種廣譜的抗生素，對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌均有抗性，所以從抗菌譜上看，該活性物質與大觀霉素還是有較大差異。因此其結構還需要得到足夠量的樣品后運用核磁共振等技術來確定。

對水稻白葉枯病害的溫室生防實驗表明，經(jīng)過A493無菌發(fā)酵上清液處理，水稻生長20d后對水稻白葉枯病害防治效果達到了66．7%，且對水稻的正常生長無不良影響。表明該活性物質在防治水稻白葉枯病害方面具有良好的生防前景。

3 結論

以水稻黃單胞菌等植物病原菌為指示菌，采用平板對峙法對411株海洋細菌進行了抗菌篩選，初篩獲得具有抗菌活性的海洋菌株81株，復篩獲得具有穩(wěn)定抗菌活性的菌株7株，最后通過測定抗菌譜，得到1株抗菌譜特異并且穩(wěn)定拮抗水稻黃單胞菌的深海獨島枝芽胞桿菌（Virgibacillus dokdonensis）A493。對水稻白葉枯病害的溫室生防實驗表明，經(jīng)過A493無菌發(fā)酵上清液處理，水稻生長20d后對水稻白葉枯病害的防治效果達到了66．7%，且對水稻的正常生長無不良影響。通過離子交換色譜法提取，再經(jīng)2次薄層層析硅膠板回收分離，得到了純化活性物質，經(jīng)過ESI－MSn分析，初步判斷活性物質分子量為317Da。Doskochilova系統(tǒng)紙層析結果顯示活性物質很可能為新的氨基糖苷類物質。

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