不同冷凍時間對異體神經(jīng)移植后生理特性的影響

張 勇，陳德龍，陳小龍，曾希銀，聶春福

（遂寧市第一人民醫(yī)院骨科，四川 629000）

異體神經(jīng)是臨床上修復(fù)長段主要神經(jīng)缺損重要的研究材料。但它最大弊端是免疫排斥［1］，從而影響神經(jīng)移植后的生理特性。在這方面國內(nèi)外學(xué)者做了大量的基礎(chǔ)研究［2－8］。研究普遍認為：降低異體神經(jīng)移植免疫排斥的較好方法是超深低溫（－196℃）冷凍保存。那么，究竟保存多長時間才能使移植后的生理特性最佳呢？目前最長研究時間為3周，更長的時間有待進一步探索。本研究的目的就是觀察超深低溫條件下不同冷凍時間對異體神經(jīng)移植后生理特性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑和器械 甘油（純度大于99.0%，瀘州生物試劑公司）；水合氯醛（純度大于98.0%，瀘州生物試劑公司）；電鏡（JEM－1400，日本電 子株式會社）；光鏡 （Olympus Bx50，蘇州易微光學(xué)公司）；顯微手術(shù)鏡（XTS－4A，江蘇鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器公司）；電生理實驗系統(tǒng)（BL－420F，成都生物設(shè)備有限公司）。

1.2 實驗動物及分組 80只雌性Wistar大鼠（重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供），質(zhì)量（280±30）g。取材組20只，其余60只按隨機原則分為對照組（A組：新鮮自體神經(jīng)移植組；B組：新鮮異體神經(jīng)移植組，每組10只）和實驗組（按取材組神經(jīng)在－196℃條件下保存3、6、9、12周后移植分為C、D、E、F組，每組10只。）

1.3 方法

1.3.1 取材 用水合氯醛將Wistar大鼠麻醉后，暴露雙側(cè)的坐骨神經(jīng)，切取神經(jīng)干1.0cm，總計40根。將取下的神經(jīng)分4組每組10根放于50%甘油的EP管中，而后在超深低溫條件下按不同冷凍時間進行保存。

1.3.2 神經(jīng)移植 A組：坐骨神經(jīng)取下后立即原位移植于自體；B組：坐骨神經(jīng)取下后立即兩兩交叉移植；C、D、E、F組分別在坐骨神經(jīng)冷凍保存相應(yīng)時間后，在常溫下（25℃）用生理鹽水復(fù)溫，按隨機原則進行移植。所有組別術(shù)后均不用藥物處理。

1.3.3 觀察指標 術(shù)后間隔一定時間觀察移植側(cè)肢體的情況；術(shù)后3、6、9周做神經(jīng)電生理檢測，術(shù)后第9周做光鏡、電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用表示，各組間采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 A組術(shù)后第3天大鼠足部輕微腫脹糜爛，術(shù)后1周趨于穩(wěn)定，術(shù)后3周腫脹糜爛漸消，移植段表面散在少許毛細血管分布，和周圍組織無黏連。術(shù)后6周腫脹糜爛基本消除，移植段神經(jīng)表面分布大量毛細血管。術(shù)后9周腫脹糜爛完全消除，移植段神經(jīng)表面已形成網(wǎng)狀毛細血管。B組術(shù)后第3天足部腫脹糜爛便很明顯，術(shù)后1周足趾便開始散在性脫落，術(shù)后3周腫脹糜爛范圍加大，程度加深，移植段神經(jīng)和周圍組織黏連重，神經(jīng)表面毛細血管稀少。術(shù)后6周趨于穩(wěn)定，移植段神經(jīng)與周圍組織黏連很嚴重，神經(jīng)表面只可見少量毛細血管。術(shù)后9周糜爛基本修復(fù)，移植段神經(jīng)近遠端被纖維組織包裹，難以分離，神經(jīng)表面毛細血管依舊稀少。D、C組很接近，稍遜于A組，明顯優(yōu)于B組。E、F組的效果優(yōu)于B組，遜于A、C、D組；E組的效果稍好于F組。

2.2 神經(jīng)電生理 動作電位峰值、神經(jīng)傳導(dǎo)速度統(tǒng)計分析：移植3周、6周后：A組與B、C、D、E、F組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。移植9周后，A組和B、E、F組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組與C、D組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；C、D組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這說明坐骨神經(jīng)組冷凍保存3周、6周后移植，9周后的電生理特性近似于A組，見表1、2。

2.3 光鏡觀察 各組別術(shù)后9周取移植神經(jīng)中段做半薄切片HE染色觀察，結(jié)果見圖1。A組：少量軸突腫脹和空泡變性，軸突密度高，施萬細胞大小均一增生明顯，極其少量的淋巴細胞浸潤，新生毛細血管大量生成；B組：空泡變性明顯，大部分軸突水腫，施萬細胞大小不一散在增生，淋巴細胞大范圍、高密度浸潤，少量新生毛細血管；C、D組無明顯差別，整體效果接近于A組；E組差于A、C、D組，優(yōu)于B、F組，F(xiàn)組優(yōu)于B組。

圖1 術(shù)后9周各組光鏡結(jié)果（×200）

圖2 術(shù)后9周各組電鏡結(jié)果（×12000）

表1 術(shù)后3、6、9周各組別動作電位峰值（，n＝5，mV）

表1 術(shù)后3、6、9周各組別動作電位峰值（，n＝5，mV）

a：P＜0.05，與A組比較。

組別 3周 6周 9周8.15±0.43 8.93±0.69 9.02±0.78 B組 4.97±0.18 5.29±0.82 5.80±0.32a C組 7.01±0.39 8.13±0.12 8.89±0.69 D組 7.23±0.46 8.21±0.57 8.92±0.44 E組 6.03±0.61 7.17±0.72 7.57±0.52a F組 5.91±0.82 6.81±0.59 7.19±0.39 A組a

表2 術(shù)后3、6、9周各組別神經(jīng)傳導(dǎo)速度（mV，，n＝5）

表2 術(shù)后3、6、9周各組別神經(jīng)傳導(dǎo)速度（mV，，n＝5）

a：P＜0.05，與A組比較。

組別 3周 6周 9周10.24±0.42 12.44±0.17 12.57±0.67 B組 5.22±0.38 5.87±0.41 6.81±0.36a C組 7.69±0.89 9.15±0.38 12.03±0.42 D組 7.93±0.32 9.37±0.22 12.21±0.39 E組 5.96±0.46 7.29±0.42 9.12±0.73a F組 5.68±0.89 7.08±0.56 9.01±0.64 A組a

2.4 電鏡觀察 各組別術(shù)后9周取移植神經(jīng)中段做超薄切片電鏡觀察，結(jié)果見圖2。A組：髓鞘外形光滑，發(fā)育成熟，有髓或無髓神經(jīng)纖維大量再生，施萬細胞軸漿均勻、豐富，呈旺盛狀，效果最好。B組：難見神經(jīng)纖維、施萬細胞、軸突再生，紊亂的結(jié)締組織多見，效果最差。C、D組差別不大但稍遜于A組。E、F組明顯差于A、C、D組。

3 討 論

3.1 自體和異體神經(jīng)移植后生理特性差別的主要原因 通過本實驗可以看出：自體神經(jīng)移植后生理特性是明顯優(yōu)于異體神經(jīng)的。造成其差別的主要原因是免疫排斥的影響。免疫排斥是機體對移植物（異體細胞、組織或器官）通過特異性免疫應(yīng)答使其遭受破壞的過程。一般是指移植術(shù)后，受者可識別移植物抗原并產(chǎn)生應(yīng)答，移植物中免疫細胞也可識別受者抗原組織并產(chǎn)生應(yīng)答。在同種異體移植中，排斥反應(yīng)有兩種基本類型：宿主抗移植物反應(yīng)（HVGR）和移植物抗宿主反應(yīng)（GVHR）。免疫排斥反應(yīng)過程既有細胞介導(dǎo)的又有的抗體介導(dǎo)。異體神經(jīng)移植后的免疫排斥，主要組織相容性復(fù)合體（MHC）起了主要作用［9－10］，它存在于施萬細胞，是主要的抗原成分。此外，神經(jīng)基底膜管的完整性也會影響神經(jīng)的再生修復(fù)后的生理特性，因為它是神經(jīng)固有基質(zhì)框架。因此，最大限度地去除施萬細胞抗原性并保留基底膜管的完整性是優(yōu)化異體神經(jīng)移植后生理特性的必要條件。

3.2 冷凍處理法對異體神經(jīng)移植后生理特性的影響 異體神經(jīng)經(jīng)超深低溫冷凍處理后，主要抗原成分被最大限度清除，而且對神經(jīng)基底膜管的完整性損傷較小，最大程度降低了異體神經(jīng)移植的免疫排斥性，使異體神經(jīng)移植后的生理特性得到優(yōu)化［11－12］。這種兼顧二者的特性使其比化學(xué)法［13］、放射輻照法［14］、川芎嗪處理法［15］、綠茶多酚處理法［16］、免疫抑制法［17］顯得更勝一籌。通過本實驗可以看出：冷凍法異體神經(jīng)處理后，其移植免疫后的生理特性可以得到不同程度的改善，再生效果優(yōu)于新鮮異體神經(jīng)移植。

3.3 不同冷凍時間對異體神經(jīng)移植后生理特性的影響 冷凍法處理異體神經(jīng)后，雖然可以改善移植后的生理特性，但若保存時間過短，難以清除施萬細胞的抗原成分，排斥反應(yīng)仍然強烈，生理特性難以達到最佳狀態(tài)；反之過長，冰晶會對基底膜管造成機械性和滲透性損傷［18］，也將影響移植后的生理特性。由此可知，異體神經(jīng)冷凍保存存在一個最佳時間。有研究表明，冷凍保存時間低于3周，異體神經(jīng)移植后效果明顯遜于新鮮自體神經(jīng)移植［19］。從本實驗可以看出，冷凍保存時間太長，如9、12周后的移植效果也是明顯次于新鮮自體神經(jīng)移植的，而保存3周、6周后的移植效果卻和新鮮自體神經(jīng)移植很接近。由此可知：異體神經(jīng)移植后的生理特性與冷凍時間存在依存關(guān)系。不過，3周到6周之間的冷凍移植效果尚未明確，仍需進一步的探索。

冷凍時間的長短對異體神經(jīng)移植后的生理特性起了極大的影響作用，找到最佳的保存時間顯得尤為重要。最佳的保存時間不僅可以使異體神經(jīng)移植后的生理特性達到最優(yōu)狀態(tài)，更能使移植后的恢復(fù)效果達到最佳，是極有臨床實用價值和發(fā)展前景的。

［1］Moore AM，MacewanM，Santosa KB，et al.Acellular nerve allografts in peripheral nerve regeneration：A comparative study［J］.Muscle Nerve，2011，44（2）：221－234.

［2］Wang G，Lu S，Kuang Z，et al.Experimental study on promotion of neurotropic reinnervation with chemically extracted acellular nerve allograft［J］.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2010，24（11）：1288－1292.

［3］唐圓，劉湘華，劉丹，等.以組織工程建構(gòu)技術(shù)修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的難點［J］.中國組織工程研究，2013，17（7）：1295－1304.

［4］Tang X，Xue C，Wang Y，et al.Bridging peripheral nerve defects with a tissue engineered nerve graft composed of an in vitro cultured nerve equivalent and a silk fibroinbased scaffold［J］.Biomaterials，2012，33（15）：3860－3867.

［5］馬英華，宋有鑫，胡大為，等.冷凍保存后不同長度異體神經(jīng)移植的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2011，19（13）：1137－1139.

［6］郭義柱，王巖，劉相成，等.同種異體神經(jīng)移植治療銳性臂叢神經(jīng)缺損5例臨床研究［J］.軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2011，32（4）：317－318.

［7］Rustemeyer J，van de Wal R，Keipert C，et al.Administration of low－dose FK 506accelerates histomorphometric regeneration and functional outcomes after allograft nerve repair in a rat model［J］.J Craniomaxillofac Surg，2010，38（2）：134－140.

［8］Giusti G，Willems WF，Kremer T，et al.Return of motor function after segmental nerve loss in a rat model：comparison of autogenous nerve graft，collagen conduit，and processed allograft（AxoGen）［J］.J Bone Joint Surg Am，2012，4（5）：410－417.

［9］楊小華，韓金豹，張沉冰，等.同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)兔周圍神經(jīng)缺損［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（34）：6315－6318.

［10］李曉峰，趙勁民，秦義武，等.三種不同方法制備去細胞神經(jīng)支架的比［J］.中國組織工程研究，2012，16（47）：8817－8820.

［11］Szynkaruk M，Kemp SW，Wood MD，et al.Experimental and clinical evidence for use of decellularized nerve allografts in peripheral nerve gap reconstruction［J］.Tissue Eng Part B Rev，2013，19（1）：83－96.

［12］Brooks DN，Weber RV，Chao JD，et al.Processed nerve allografts for peripheral nerve reconstruction：A multicenter study of utilization and outcomes in sensory，mixed，and motor nerve reconstructions［J］.Micro Surg，2012，32（1）：1－14.

［13］趙喆，王玉，彭江，等.化學(xué)去細胞異體神經(jīng)周圍復(fù)合BMSCs生物蛋白膠復(fù)合物促周圍神經(jīng)缺損修復(fù)［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2011，25（4）：488－493.

［14］王然蕓，郭永明，郭義.周圍神經(jīng)再生和修復(fù)的研究進展［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（3）：260－261.

［15］鐘建，陽明明，蔣電明.不同溫度下含川芎嗪UW液保存對異體神經(jīng)再生影響的實驗研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，37（4）：341－344.

［16］周勝虎，甄平，高明暄，等.輻照和綠茶多酚處理同種異體神經(jīng)移植體的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2012，（20）：1882－1885.

［17］宋仁綱，張震宇.FK506對異體神經(jīng)移植的促神經(jīng)再生作用研究進展［J］.中國矯形外科雜志，2011，19（22）：1883－1886.

［18］Ray WZ，Kale SS，Kasukurthi R，et al.Effect of cold nerve allograft preservation on antigen presentation and rejection［J］.J Neurosurg，2011，114（1）：256－262.

［19］王秋根，項耀均，崔義，等.不同溫度和時間保存異體神經(jīng)移植后對鼠軸突再生的影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998，19（1）：67－70.