大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期ADAMTS－4的表達(dá)與血腦屏障通透性的相關(guān)性研究

岳四海，劉獻(xiàn)志，張宏鳳

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科／鄭州市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 450000）

動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種具有較高病死率與病殘率的神經(jīng)外科急癥，近年來大量的基礎(chǔ)及臨床研究表明早期腦損傷（early brain injury，EBI）可能在蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后的病理進(jìn)程中起著重要的作用，這使得近年來人們的注意力開始轉(zhuǎn)向SAH后的EBI［1］。EBI包含眾多病理機(jī)制，其中血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的破壞是EBI的重要病理機(jī)制之一，而導(dǎo)致BBB破壞的諸多因素中細(xì)胞外基質(zhì)的損傷非常重要［2－3］。ADAMTS－4（a disintegrin－like and metalloproteinase with thrombospondin type l motifs－4）是ADAMTSs家族中一員，是一種新發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶，ADAMTS－4可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)參與多種病理生理過程［4］，本研究旨在對(duì)ADAMTS－4在SAH后早期腦損傷中的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量250～300 g。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和SAH組，其中對(duì)照組共12只，6只用于檢測(cè)ADAMTS－4mRNA及蛋白表達(dá)水平，6只用于血腦屏障通透性檢測(cè)，且均于術(shù)后72h處死。SAH組（60只），按處死時(shí)間6、12、24、48、72h分為5個(gè)亞組。

1.2 方法

1.2.1 SAH模型的制作 采用改良的Sheffield大鼠SAH模型［5］，向頸內(nèi)動(dòng)脈插入長約5cm前端銳化的3－0尼龍線，SAH組在插入2.0～2.5cm時(shí)多感到明顯阻力，克服阻力再插入2mm后，迅速退出尼龍線，恢復(fù)頸內(nèi)動(dòng)脈血流并結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，縫合頸部切口，對(duì)照組插入尼龍線約1.5～2.0 cm后不再繼續(xù)插入。

1.2.2 大鼠海馬組織ADAMTS－1的 Western blotting分析 提取含30μg蛋白的樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）凝膠電泳。加入 Anti－ADAMTS－4（1∶1000，Abcam，美國）并4℃孵育過夜，羊抗鼠IgG－HRP（1∶2000，中杉金橋，中國）室溫孵育2h，顯色后由quantityone軟件系統(tǒng)計(jì)算ADAMTS－4和β－actin的光密度值，二者比值作為該樣品ADAMTS－1蛋白的表達(dá)量。

1.2.3 ADAMTS－4的mRNA的檢測(cè) 按Trizol試劑盒說明提取海馬組織總RNA。根據(jù)RNA濃度（μg／mL）＝OD206×40μg／mL×稀釋倍數(shù)，計(jì)算RNA濃度。采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）試劑盒配置反應(yīng)體系。ADAMTS－4上游引物：5′－GTG AAT ACA CGC TGA TGC C－3′下游引物：5′－AGC CGG GAC AGT GAG GTT－3′擴(kuò)增片斷為312bp。內(nèi)參GAPDH 上游引物：5′－GTG CTG AGT ATG TCG TGG AGT CT－3′，下游引物：5′－GTG GAA GAA TGG GAG TTG CTG T－3′擴(kuò)增片段610bp。RT－PCR產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠上電泳，采用quantity－one圖像處理系統(tǒng)分析比較電泳條帶相對(duì)光密度值。

1.2.4 腦伊文氏藍(lán)（Evans blue，EB）濃度的檢測(cè) 經(jīng)股靜脈注向已麻醉大鼠注射2%EB（5mL／kg），1h后經(jīng)左心室注入37℃生理鹽水，待流出液清亮后迅速斷頭取腦，置37℃恒溫水浴箱中，48h后離心取上清液，紫外分光光度計(jì)波長632nm比色測(cè)定吸光度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織EB濃度（mg／g腦濕重）。

1.2.5 α2巨球蛋白抑制ADAMTS－4表達(dá)在EBI病理過程中的作用 此部分研究共分為3個(gè)組，分別為：假手術(shù)組、藥物干預(yù)組和非干預(yù)組，每組各6只SD大鼠，模型制作方法同上，藥物干預(yù)組為：術(shù)后股靜脈注射ADAMTS－4抑制劑α2巨球蛋白每次120mg，每12小時(shí)1次。各組大鼠均于術(shù)后48h后處死，分別進(jìn)行蛋白提取測(cè)定及EB濃度檢測(cè)，方法同上。比較3組的蛋白表達(dá)及EB濃度，進(jìn)一步檢測(cè)ADAMTS－4在SAH后的EBI過程中對(duì)血腦屏障的作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，用LSD－t檢驗(yàn)比較兩組間的差異，變量之間采用pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠海馬組織ADAMTS－4蛋白表達(dá)水平變化 SAH后6、12h組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SAH后24hADAMTS－4蛋白與對(duì)照組相比表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；SAH后72hADAMTS－4蛋白活性仍然維持在較高水平，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組ADAMTS－4及β－Actin的表達(dá)

2.2 大鼠海馬組織ADAMTS－4mRNA表達(dá)變化 SAH 后6、12h組大鼠海馬組織ADAMTS－4mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SAH 后24hADAMTS－4 mRNA表達(dá)開始增高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SAH 后48hADAMTS－4mRNA 表達(dá) 達(dá)到高峰；72h ADAMTS－4mRNA表達(dá)較48h開始下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表1。

2.3 SAH后大鼠血腦屏障通透性改變 SAH后12hEB濃度較對(duì)照組開始顯著增加（P＜0.05）；SAH后48hEB濃度最高，72hEB濃度較48h有所降低但仍維持在較高水平，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 大鼠海馬ADAMTS－4蛋白表達(dá)與腦內(nèi)EB濃度的相關(guān)性 SAH后ADAMTS－4蛋白表達(dá)與腦內(nèi)EB濃度整體呈正相關(guān)（r＝0.917，P＜0.05）。

圖2 RT－PCR檢測(cè)每組 ADAMTS－4及GAPDH的mRNA的表達(dá)

表1 ADAMTS－4mRNA和蛋白的表達(dá)變化及大鼠腦內(nèi)EB濃度的變化（）

表1 ADAMTS－4mRNA和蛋白的表達(dá)變化及大鼠腦內(nèi)EB濃度的變化（）

a：P＜0.05：與SAH后24h相比；b：P＜0.05，與對(duì)照組相比。

組別 n mRNA 蛋白濃度 EB 60.197±0.049 0.189±0.041 8.091±0.198 SAH組6h 60.228±0.040a 0.216±0.046a 7.815±0.153a 12h 60.249±0.035a 0.202±0.043a 18.336±0.316b 24h 60.712±0.094b 0.634±0.069b 23.122±0.584b 48h 60.833±0.068b 0.824±0.074b 29.753±0.249b 72h 60.556±0.059b 0.755±0.047b 17.462±0.631濃度對(duì)照組b

2.5 α2巨球蛋白干預(yù)后ADAMTS－4的蛋白表達(dá)及EB濃度的變化 經(jīng)α2巨球蛋白干預(yù)后，SAH后48hADAMTS－4蛋白表達(dá)較非干預(yù)組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且干預(yù)組腦內(nèi)EB濃度較非干預(yù)組亦有顯著減少（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 Western blotting檢測(cè)各組ADAMTS－4及β－Actin的表達(dá)

表2 ADAMTS－4蛋白的表達(dá)變化及大鼠腦內(nèi)EB濃度的變化

3 討 論

自發(fā)性SAH是一種嚴(yán)重的神經(jīng)外科急癥，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂是自發(fā)性SAH的最主要原因［6］。近年來SAH后EBI越來越引起人們的重視，并認(rèn)為其在SAH后的病理進(jìn)程中起著重要的作用，EBI指的是SAH后72h以內(nèi)腦內(nèi)所發(fā)生的病理改變，其包含眾多復(fù)雜病理機(jī)制，如包括顱內(nèi)壓升高、腦灌注壓降低、血腦屏障破壞、血管收縮、細(xì)胞死亡途徑的激活、壞死、凋亡及自噬性死亡離子穩(wěn)態(tài)的失衡、NO／NOS途徑的活化、氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放等［7－9］，其中BBB的破壞是EBI的重要組成部分，其早期功能障礙促進(jìn)了腦水腫的發(fā)生，而細(xì)胞外基質(zhì)的降解是導(dǎo)致BBB破壞的重要原因［10］。ADAMTS意為含I型血小板結(jié)合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白樣金屬蛋白酶，是繼基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs后新發(fā)現(xiàn)的一類Zn2＋依賴的分泌型金屬蛋白酶，ADAMTS－4的功能是ADAMTSs中研究較為透徹的成員之一，可以特異性降解aggrecan，brivecan和versican［11－13］。目前已知的ADAMTS酶系的調(diào)節(jié)機(jī)制是它可以被金屬蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)，其中金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）是內(nèi)源性的，且金屬蛋白酶抑制劑TIMP－3及α2巨球蛋白是ADAMTS－4和－5的重要的抑制劑［17］。有研究顯示在惡性膠質(zhì)瘤中，ADAMTS－4的表達(dá)水平明顯升高，通過降解brivecan，介導(dǎo)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［14－15］。Cross等［16］研究顯示早期腦梗死時(shí)ADAMTS－4表達(dá)上調(diào)，并參與破壞了BBB的完整性。但有關(guān)SAH后EBI中ADAMTS－4與BBB的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究采用改良的血管內(nèi)穿刺法建立大鼠SAH的動(dòng)物模型，定量檢測(cè)了ADAMTS－4在SAH后72h內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，同時(shí)與之對(duì)應(yīng)的檢測(cè)了大鼠腦內(nèi)EB濃度以衡量其BBB的變化。結(jié)果顯示ADAMTS－4的mRNA和蛋白表達(dá)高峰均出現(xiàn)在出血后48h，且此時(shí)EB濃度亦達(dá)到最大值。統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)：SAH后早期大鼠腦內(nèi)EB濃度與ADAMTS－4蛋白活性呈正相關(guān)，提示SAH后大鼠BBB損害可能與ADAMTS－4降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致BBB結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。隨后通過應(yīng)用ADAMTS－4抑制劑α2巨球蛋白進(jìn)行干預(yù)，并檢測(cè)干預(yù)后ADAMTS－4的蛋白表達(dá)與腦內(nèi)EB濃度變化，進(jìn)一步證實(shí)ADAMTS－4可能參與了SAH后BBB的損害這一病理過程。

ADAMTSs底物譜相對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs選擇性較高、特異性較強(qiáng)，所以進(jìn)一步深入研究ADAMTS－4在SAH后EBI及整個(gè)病理過程中的相關(guān)機(jī)制，可能為SAH的治療提供新的方向。

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