烏司他丁對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇后細(xì)胞因子和心功能影響的實(shí)驗(yàn)研究＊

楊秀林，周厚榮，劉海健，楊嬌榮，周 霞

（貴州省人民醫(yī)院急診科，貴陽(yáng) 550002）

盡管心肺復(fù)蘇后自主循環(huán)恢復(fù)（restoration of spontaneous circulation，ROSC）成功率有了極大提高，但ROSC后大約75%的患者死于進(jìn)展性的復(fù)蘇后多器官功能障礙綜合征（post－resuscitation multiple organ dysfunction syndrome，PRMODS），多項(xiàng)臨床研究表明PR－MODS和全身炎癥反應(yīng)有關(guān)［1］。烏司他?。╱linastatin，UTI）是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，具有抑制水解酶，穩(wěn)定溶酶體膜，抑制多種炎癥介質(zhì)及免疫調(diào)節(jié)作用。為此，推測(cè)烏司他丁可能減輕ROSC后的全身炎癥反應(yīng)，改善PR－MODS。本研究特通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，考察UTI對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠心功能、細(xì)胞因子的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年SD大鼠 （重慶大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：sCXK（渝）2007－0005）20只，雌雄不限，體質(zhì)量310～450g。烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990134，批號(hào)：03051203）。大鼠腦鈉肽（BNP）、心肌肌鈣蛋白 T（cTnT）、白介素－12（IL－12）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，酶鏈免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法由貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室專人操作。ASB－240U生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)（成都傲生科技公司）、ALC－V9動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾特生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 隨機(jī)將SD大鼠分為3組：A組（不進(jìn)行窒息及心肺復(fù)蘇，僅進(jìn)行麻醉和氣管切開(kāi)插管、血管穿刺；n＝8）；B組（靜脈注射生理鹽水4mL·kg－1，心搏驟停4min后給藥；n＝6）；C組（烏司他丁5萬(wàn) U·kg－1＋生理鹽水3 mL·kg－1，5萬(wàn) U配制成1mL，心搏驟停4min后給藥；n＝6）；其中B組和C組按時(shí)間又分為復(fù)蘇后0和6h2小組；術(shù)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自由飲水但禁食。B、C組間體質(zhì)量（380±21）g vs.（380±19）g、窒息導(dǎo)致 CA時(shí)間（423±26）s vs.（402±22）s、心肺復(fù)蘇（CPR）持續(xù)時(shí)間（192±110）s vs.（173±46）s、ROSC時(shí)間（612±116）s vs.（575±47）s，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組間復(fù)蘇即刻、復(fù)蘇后6h±LVdp.dt－1max、LVEDP、MAP變化（）

表1 各組間復(fù)蘇即刻、復(fù)蘇后6h±LVdp.dt－1max、LVEDP、MAP變化（）

a：P＜0.01，與A組同時(shí)點(diǎn)比較；b：P＜0.01，與同組0h比較；c：P＜0.01，與B組同時(shí)點(diǎn)比較。

項(xiàng)目復(fù)蘇后 A組（n＝8） B組（n＝6） C組（n＝6）0h 7.98±1.32 8.10±1.73 7.81±1.306h 7.30±1.12 2.85±0.91ab 5.48±1.44abc－LVdp／dt max（mmHg／s×103） 0h 5.48±1.35 5.86±1.00 6.12±1.346h 5.19±1.43 1.83±0.91ab 4.45±1.45abc LVEDP（mmHg） 0h 3.50±2.11 3.04±1.48 3.36±1.176h 3.52±2.19 15.98±5.81ab 9.23±4.94abc MAP（mmHg） 0h 92.42±15.61 88.74±13.39 90.61±16.766h 94.52±13.80 60.18±14.10ab 82.26±14.58＋LVdp／dt max（mmHg／s×103）c

表2 各組間復(fù)蘇即刻、復(fù)蘇后6hBNP、cTnT、TNF－α、IL－12變化（，pg·mL－1）

表2 各組間復(fù)蘇即刻、復(fù)蘇后6hBNP、cTnT、TNF－α、IL－12變化（，pg·mL－1）

a：P＜0.01，與A組同時(shí)點(diǎn)比較；b：P＜0.01，與同組0h比較；c：P＜0.01，與B同時(shí)點(diǎn)比較。

項(xiàng)目 復(fù)蘇后 A組（n＝8） B組（n＝6） C組（n＝6）286h 167.61±49.32 610.52±140.86ab 405.62±100.33abc cTNT 0h 3.72±1.13 3.92±0.90 4.01±1.126h 3.72±1.13 133.04±41.02ab 63.38±8.65abc TNF－α 0h 30.72±11.50 46.99±18.71 56.44±19.676h 30.72±11.50 242.27±61.56 ab 133.30±32.87abc IL－12 0h 133.90±41.02 140.25±23.46 172.58±47.636h 133.90±41.02 672.70±83.94ab 336.29±73.6 BNP 0h 167.61±49.32 181.13±56.21 165.54±65.abc

1.2.2 心肺復(fù)蘇模型 依據(jù)Hendrickx等窒息法心肺復(fù)蘇模型，并參照Utstein復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)研究模式設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停貉雠P固定于手術(shù)臺(tái)上的動(dòng)物，采用腹腔注射麻醉（烏拉坦，首劑為2g·kg－1）后，氣管切開(kāi)置管接呼吸機(jī)；平均動(dòng)脈壓（MAP）、心率（HR），Ⅱ?qū)CG等數(shù)據(jù)由左頸動(dòng)脈置管連接生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)采錄。術(shù)后穩(wěn)定10min（室溫），采用夾閉氣管置管法，于呼氣末持續(xù)夾閉氣管置管致CA持續(xù)240s［CA標(biāo)準(zhǔn)：（1）心電圖示心電靜止、室顫、心電機(jī)械分離；（2）心尖區(qū)心臟搏動(dòng)消失；（3）動(dòng)物皮膚黏膜明顯發(fā)紺。］后，即胸外按壓（頻率為200次／分），靜脈注射腎上腺素（0.02mg·kg－1）并呼吸機(jī)輔助純氧通氣（80次／分；潮氣量6mL·kg－1）等方法進(jìn)行動(dòng)物心肺復(fù)蘇（15min無(wú)效者放棄復(fù)蘇），同時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄頸動(dòng)脈血壓和心電圖，ROSC 3h后逐步撤離呼吸機(jī)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束（取血6mL送檢，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）。時(shí)間數(shù)據(jù)收集：窒息導(dǎo)致CA的時(shí)間、心肺復(fù)蘇時(shí)間和ROSC時(shí)間。

1.2.3 觀察指標(biāo) 復(fù)蘇前、復(fù)蘇后0h及復(fù)蘇后6hHR、MAP、左室內(nèi)壓最大上升與下降速率（±LVdp.dt－1max）、左室舒張末壓（LVEDP）、腦鈉肽（BNP）、IL－12、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、心肌鈣蛋白（cTNT）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，同組不同時(shí)點(diǎn)采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)，不同組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊采用成組設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較用SNK法，如方差不齊，采用Wilcoxon檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組間復(fù)蘇即刻、復(fù)蘇后6h±LVdp.dt－1max、LVEDP變化 與A組及同組復(fù)蘇后0h比較，B、C組復(fù)蘇后6h±LVdp.dt－1max值均降低（P＜0.01），而復(fù)蘇后6hLVEDP值均升高（P＜0.01）；B組復(fù)蘇后6hMAP低于復(fù)蘇前、A組和C組（P＜0.01）；與B組比較，C組復(fù)蘇后6h±LVdp.dt－1max、MAP值均高于B組（P＜0.01），而LVEDP低于B組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組間復(fù)蘇即刻、復(fù)蘇后6hBNP、cTnT、TNF－α、IL－12變化 與A組及同組復(fù)蘇后0h比較，B、C組復(fù)蘇后6h BNP、cTnT、IL－12、TNF－α水平均升高（P＜0.01）；與 B組比較，C組復(fù)蘇后6hBNP、cTnT、IL－12、TNF－α水平低于 B組（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

3 討 論

心臟驟停CPR后死亡者中心功能不全占1／3以上，最終死亡的主要危險(xiǎn)因素之一是復(fù)蘇術(shù)后高達(dá)90.6%全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）發(fā)生［2－3］。導(dǎo)致 SIRS的炎癥介質(zhì)中，IL－12能引起NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌TNF－α，后者又反過(guò)來(lái)激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌其他促炎因子，因此，IL－12在SIRS和MODS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］。而高度依賴于IL－12表達(dá)的TNF－α是觸發(fā)缺血再灌注損傷時(shí)炎癥瀑布效應(yīng)的關(guān)鍵因子［5］，對(duì)其表達(dá)的抑制，將使缺血再灌注損傷程度均明顯減輕［6－7］。對(duì)眾多研究結(jié)果歸納顯示炎性因子、心肌細(xì)胞凋亡、微血管損傷、鈣離子超載、自由基等與復(fù)蘇后心功能不全密切相關(guān)［8］。本次實(shí)驗(yàn)顯示，心肺復(fù)蘇后大鼠體內(nèi) TNF－α和IL－12表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示復(fù)蘇后大鼠體內(nèi)存在炎性細(xì)胞激活。

UTI可競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶底物結(jié)合部位，同時(shí)獨(dú)立抑制多種酶的活性［9］，具有拮抗心肺復(fù)蘇后TNF－α及降低心肌再灌注損傷作用［10－11］，對(duì)SIRS、MODS等引起的組織或器官損傷具有保護(hù)作用［12］。鑒于烏司他丁研究資料的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)具有較大的相關(guān)性，特選為本實(shí)驗(yàn)研究用藥。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與A組比較，B、C組復(fù)蘇后6h±LVdp.dt－1max值均低于A組（P＜0.01），而復(fù)蘇后6hLVEDP值均高于C組（P＜0.01）；與同組0h比較，B、C組復(fù)蘇后6h±LVdp.dt－1max值均降低（P＜0.01），而復(fù)蘇后6hLVEDP值均升高（P＜0.01），提示復(fù)蘇后心功能不全普遍存在，結(jié)果也印證相關(guān)資料的報(bào)道［1］。

對(duì)心肌損傷的標(biāo)志物cTnT［13］和心臟負(fù)荷的標(biāo)志物BNP的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：心肺復(fù)蘇前各組cTnT和BNP值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），復(fù)蘇成功后6hB、C組均有不同程度升高，尤以B組升高幅度最大，推測(cè)復(fù)蘇后存在一定程度的急性心肌損傷及心肌細(xì)胞壞死。然而C組升高幅度小于B組（P＜0.01），從另外一個(gè)角度證實(shí)UTI具有減輕心肺復(fù)蘇后心肌損傷的作用［14］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UTI可有效的調(diào)節(jié)IL－12、TNF－α，與B照組及A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，C組MAP、±LVdp.dt－1max、LVEDP數(shù)據(jù)優(yōu)于B組，揭示 UTI還具有改善了復(fù)蘇后心功能不全的作用［15］。

本研究結(jié)果表明：烏司他丁對(duì)心搏驟停－心肺復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)大鼠，具有拮抗炎癥介質(zhì)、減輕心肌損傷和改善了復(fù)蘇后心功能不全的作用。烏司他丁使用方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響評(píng)價(jià)后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)進(jìn)行。

［1］胡春林，夏金明，魏紅艷，等.烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后兔腦損傷和心功能的影響［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2012，21（1）：12－17.

［2］唐萬(wàn)春，孫士杰.心肺腦復(fù)蘇及心腦血管急診［M］.北京：科學(xué)技術(shù)出版社，2008：397－399.

［3］周厚榮，張謙，楊秀林，等.血必凈對(duì)窒息大鼠心肺復(fù)蘇后免疫因子及補(bǔ)體變化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（17）：2248－2250.

［4］陳振娟，阮冰.全身炎癥反應(yīng)綜合征的分子發(fā)病機(jī)制及其治療研究［J］.國(guó)際流行病學(xué)及傳染病學(xué)雜志，2007，34（6）：402－405，414.

［5］朱宇麟，周榮勝，楊會(huì)，等.烏司他丁對(duì)肝大部切除合并缺血再灌注損傷后肝再生及 TNF－α／IL－6／STAT－3信號(hào)通路的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（9）：1301－1306.

［6］劉作金，嚴(yán)律南.Kupffer細(xì)胞與肝臟缺血再灌注損害的研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2008，16（24）：2741－2745.

［7］Husted TL，Blanchard J，Schuster R，et al.Potential role for IL－23in hepatic ischemia／reperfusion injury［J］.Inflamm Res，2006，55（5）：177－178.

［8］劉海健，張謙，周厚榮，等.心肺復(fù)蘇后心功能不全研究進(jìn)展［J］.貴州醫(yī)藥，2010，34（1）：87－89.

［9］周世方，陳壽權(quán)，李章平，等.烏司他丁對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇后血清與海馬CA1區(qū)S100β蛋白變化的作用［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2009，18（2）：170－174.

［10］嚴(yán)躍紅，黃愛(ài)群，李顯波，等.烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后兔腎損傷的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27（6）：1138－1142.

［11］Wada T，Kawai，Ihara K，et al.Construct validity of the Enneking score for measuring function in patients with malignant or aggressive benign tumours of the upper limb［J］.J Bone Joint Surg Br，2007，89（5）：659－663.

［12］黃順偉，管向東，陳娟，等.烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1改善膿毒癥患者免疫功能的作用機(jī)制研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25（11）：2168－2172.

［13］農(nóng)天雷，林敏.肌鈣蛋白兩個(gè)亞單位在急性心肌梗死診斷中的應(yīng)用分析［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，17（3）：325－327.

［14］劉剛，王晶，趙研.烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠心功能及心肌組織 CD11b、ICAM－1的影響［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，16（4）：413－416.

［15］彭娜，向定成，羅國(guó)新，等.烏司他丁對(duì)膿毒癥休克大鼠心功能及p38MAPK活化的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（11）：1620－1622.