綿羊肺腺瘤病毒NM株囊膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測

劉 月，張宇飛，張亞坤，孫曉林，劉淑英，2＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

綿羊肺腺瘤病毒（Ovine pulmonary adenocarinoma，OPAV）是綿羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosia，OPA）的病原，主要侵害肺臟［1-3］。該病的一個重要特點是，由于與外源性綿羊肺腺瘤病毒高同源性的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒的存在，在OPA病羊體內(nèi)未曾檢測到OPAV的循環(huán)抗體而不能用常規(guī)的血清學(xué)方法進行診斷，因此抗原的檢測尤為重要［4-6］。env基因編碼反轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜蛋白，位于反轉(zhuǎn)錄病毒粒子的表面，許多逆轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜存在可產(chǎn)生中和性抗體的特異性抗原［7-8］。綿羊肺腺瘤病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒科β反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員之一，囊膜蛋白ENV在病毒粒子的表面，這一位置更利于囊膜蛋白的檢測［9］。抗體是由B淋巴細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的，可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合。本文旨在基于已獲得的綿羊肺腺瘤病毒NM株env基因序列的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的B細(xì)胞抗原表位，然后再篩選出具有合適優(yōu)勢表位的候選抗原，為研制有效的疫苗和制備特異的檢測抗體提供參考，對綿羊肺腺瘤的防控和檢測具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

OPAV-NM囊膜蛋白的氨基酸來自于Gen-Bank，序列登錄號為JQ837489。

1.2 方法

1.2.1 OPAV-NM囊膜蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 應(yīng)用 Gamier＿Robson（http：／／fasta.bioch.virginia.edu／fasta-www2／fasta-www.cgi？rm=misc1）方法、SOPMA（http：／／npsa-pbil.ibcp.fr）方法和網(wǎng)絡(luò)服 務(wù) 器 PSIPRED （http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／psipred）、Predictprotein （http：／／www.predictprotein.org）預(yù)測OPAV-NM囊膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.2 OPAV-NM囊膜蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測 利用DNA Star軟件的Protean模塊，用Kyte-Doolittle方法對囊膜蛋白的疏水性進行分析，用Emini方法預(yù)測囊膜蛋白的表面可能性，用Karplus-Schulz方法預(yù)測囊膜蛋白的柔性區(qū)域，以Jameson-Wolf方法綜合預(yù)測囊膜蛋白的B細(xì)胞抗原指 數(shù)。用 網(wǎng)絡(luò)服務(wù) 器 Bcepred（http：／／www.imtech.res.in／raghava／bcepred／bcepred-submission.html），IEDB （http：／／tools.immuneepitope.org／）和 ABCpred（http：／／www.imtech.res.in／raghava／abcpred／ABC-submission.html）預(yù)測囊膜蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列分析

利用DNA Star軟件分析推導(dǎo)的OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列與外源OPAV21（AF105220）、OPAVJS7（AF357971.1） 和 內(nèi) 源 enOPAV-20（EF680302）的囊膜蛋白氨基酸同源性分析和序列比對。雖然OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列為與enOPAV-20的同源性高達95.2%，但仍存在一個明顯的差異區(qū)段，為第548TLLGLGILVFIIIVVILIFPCLVRGMVRDFLKMRVEMLHMKYR591位氨基酸，該區(qū)段的enOPAV-20氨基酸序列有一段明顯的氨基酸序列缺失，也沒有外源性綿羊肺腺瘤病毒特有的YXXM基序（圖1）。

圖1 AF105220、AF357971、EF680302與OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸同源性分析與序列比對Fig.1 The amino acid homology analysis and sequence distances of envelope protein of between AF105220，AF357971，EF680302and OPAV-NM

2.2 OPAV-NM囊膜蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

Gamier-Robson方法是通過計算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)［10］。用該方法預(yù)測OPAV-NM囊膜蛋白二級結(jié)構(gòu)，在615個氨基酸中α螺旋占29.5%，β折疊占32.21%和β轉(zhuǎn)角占21.7%和無規(guī)則卷曲占19.2%個氨基酸，說明其二級結(jié)構(gòu)豐富，且分布相對均勻，在各β折疊單元之間存在長短不一的轉(zhuǎn)角（圖2A）。SOPMA是通過多序列比對來預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)［11］。預(yù)測α螺旋占45.2%，β折疊占18.05%，β轉(zhuǎn)角占3.09%，無規(guī)則卷曲占33.66%（圖2B）。Predictprotein服務(wù)網(wǎng)站是歐洲分子生物實驗室提供的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)網(wǎng)站，采用PHD神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預(yù)測二級結(jié)構(gòu)類型，并計算預(yù)測置信度［12］。預(yù)測囊膜蛋白615個氨基酸中α螺旋占40.98%，β折疊占12.68%，環(huán)結(jié)構(gòu)占46.34%，屬于混合型蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)殘基表面暴露超過16%的氨基酸占50.08%，兩個跨膜螺旋區(qū)383～400和550～570，與Gamier-Robson預(yù)測的α螺旋相符，胞內(nèi)區(qū)第1～382，571～615兩個區(qū)段，胞外區(qū)第401～549區(qū)段。PSIPRED服務(wù)網(wǎng)站采用雙層反饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通過對PST-BLAST搜索得到同源序列預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)［12］。預(yù)測α螺旋占53.65%，β折疊占36.26%，無規(guī)則卷曲占10.08%。雖然各種方法預(yù)測的α螺旋，β折疊，β轉(zhuǎn)角，無規(guī)則卷曲這些結(jié)構(gòu)所占比例不完全相同，但都提示蛋白質(zhì)OPAV-NM囊膜蛋白二級結(jié)構(gòu)豐富，同時OPAV-NM囊膜蛋白具有多處轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲區(qū)域，提示OPAV-NM囊膜蛋白具有較多的優(yōu)勢抗原表位區(qū)段。

圖2 A Gamier＿Robson法預(yù)測OPAV-NM囊膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 A Secondary structure of envelope protein of OPAV-NM predicted by Gamier＿Robson method

圖2 B SMOPA預(yù)測OPAV-NM囊膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 B Secondary structure of envelope protein of OPAV-NM predicted by SMOPA method

2.3 OPAV-NM囊膜蛋白的親水性（Hydrophilicity）分析

用Kyte-Doolittle方法對OPAV-NM囊膜蛋白的親水性進行分析。結(jié)果顯示該蛋白有兩個主要的疏水性區(qū)域，其位置是380～410和545～573，而且疏水性指數(shù)比較高，其中以囊膜蛋白的羧基端疏水性最高，提示可能為OPAV-NM囊膜蛋白的跨膜區(qū)。與Predictprotein預(yù)測的跨膜螺旋區(qū)相符（圖3）。

圖3 OPAV-NM囊膜蛋白的親水性分析Fig.3 Hydrophilicity for the envelope protein of OPAV-NM

2.4 OPAV-NM囊膜蛋白的表面可能性（Surface probability）分析

OPAV-NM囊膜蛋白的氨基酸呈現(xiàn)在表面可能性較大的區(qū)域主要是第167～180、第474～495、第640～615區(qū)段，其他部位展示的可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值（圖4）。

圖4 OPAV-NM囊膜蛋白的表面可能性分析Fig.4 Surface probability for the envelope protein of OPAV-NM

2.5 OPAV-NM囊膜蛋白的柔韌性（Flexible）分析

OPAV-NM囊膜蛋白骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，且分布比較均勻，氨基端的柔韌性區(qū)域比羧基端相對分布多。提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，能形成豐富的二級結(jié)構(gòu)（圖5）。

圖5 OPAV-NM囊膜蛋白骨架的柔韌性分析Fig.5 Flexible regions for the envelope protein of OPAV-NM

2.6 OPAV-NM囊膜蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測分析

Bcepred是利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測B細(xì)胞抗原表位，IEDB是利用氨基酸殘基的理化性質(zhì)和在實驗中已證明抗原發(fā)生頻率，研制開發(fā)的預(yù)測蛋白質(zhì)B細(xì)胞抗原表位的半經(jīng)驗法，ABCpred是利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預(yù)測蛋白質(zhì)B細(xì)胞抗原表位［13-16］。綜合DNA Star軟件的Protean模塊評價OPAVNM囊膜蛋白B細(xì)胞抗原表位，聯(lián)合以上蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，親水性，表面可能性和柔韌性的預(yù)測，分析OPAV-NM囊膜蛋白潛在優(yōu)勢的蛋白抗原決表位，結(jié)果顯示囊膜蛋白含有許多抗原指數(shù)好抗原性較高的區(qū)域，綜合分析結(jié)果為第52～76，101～110，118～165，182～196，201～215，281～305，309～332，335～356，461～476，530～574位，共10個區(qū)段為OPAV-NM囊膜蛋白潛在的優(yōu)勢抗原表位（圖6）。Predictprotein分析顯示第401～549區(qū)段位于胞外區(qū)，而預(yù)測的優(yōu)勢抗原表位第461～476位氨基酸序列和第530～574位的部分氨基酸序列正位于胞外區(qū)，en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)第530～574區(qū)段位于的差異區(qū)，該段氨基酸序列對綿羊肺腺瘤病毒疫苗和診斷方法的研究有重要意義。

圖6 OPAV-NM囊膜蛋白的抗原指數(shù)分析與抗原性分析Fig.6 Antigenic index analysis and antigenicity analysis of the envelope protein of OPAV-NM

3 討論

有研究表明，組成蛋白的氨基酸種類與該蛋白形成α螺旋結(jié)構(gòu)的能力有關(guān)，例如，肽鏈中脯氨酸（Pro）或甘氨酸（Gly）的出現(xiàn)頻率較高，將不利于α螺旋結(jié)構(gòu)的形成［17］。OPAV-NM囊膜蛋白中Pro出現(xiàn)的頻率是5.8%，Gly出現(xiàn)的頻率是3.6%，相對較低，根據(jù)上述二級結(jié)構(gòu)結(jié)果分析OPAV-NM囊膜蛋白中α螺旋結(jié)構(gòu)所占比例在各種預(yù)測方法中最高，但是該蛋白也具有較多的β折疊，轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)區(qū)段，因此該蛋白的二級結(jié)構(gòu)豐富。蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲是比較松散的結(jié)構(gòu)，易于發(fā)生扭曲，盤旋并展示在蛋白的表面，因此該區(qū)域通常存在B細(xì)胞的優(yōu)勢抗原表位［18］。

當(dāng)前疫苗學(xué)研制新型疫苗的一個研究熱點是利用基因工程技術(shù)，其基本技術(shù)思路是通過分析病毒的基因組序列來預(yù)測病毒的所有抗原信息，然后篩選出合適的候選抗原，進而研制出有效的疫苗，這種研制 疫 苗 的 方 法 策 略 稱 為 “反 向 疫 苗 學(xué)”［19］。OPAV-NM囊膜蛋白分析結(jié)果表明，在該蛋白近氨基端的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)區(qū)域相對較多，并且這些區(qū)域的抗原指數(shù)和親水性指數(shù)較高，呈現(xiàn)在蛋白表面的幾率也比較大，因此該區(qū)段的抗原表位應(yīng)該是OPAV-NM囊膜蛋白優(yōu)勢抗原表位所在。研究表明OPAV囊膜蛋白可被OPAV-SU單抗識別，其中SU是OPAV囊膜蛋白的表面蛋白位于囊膜蛋白氨基端部分，與本文的預(yù)測結(jié)果相符［14］。尤其是第530～574位區(qū)域位于en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列比對的差異區(qū)，且有部分氨基酸序列位于Predictprotein分析的胞外區(qū)（第401～549位），該段氨基酸序列對綿羊肺腺瘤病毒疫苗學(xué)和診斷方法的研究有重要意義。本次試驗結(jié)果可作為ex-OPAV囊膜蛋白潛在的B細(xì)胞線性表位參考數(shù)據(jù)，在今后的ex-OPAV囊膜蛋白表位研究中，應(yīng)采用軟件預(yù)測結(jié)果與試驗鑒定表位結(jié)合的方法對ex-OPAV囊膜蛋白的抗原表位加以鑒定，為今后OPAV反向疫苗學(xué)研究、多表位疫苗的研制、診斷試劑的制備及單克隆抗體的篩選提供科學(xué)的依據(jù)。

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