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    發(fā)酵木糖產(chǎn)酒精菌株的篩選和馴化

    2013-08-10 09:59:14李力群陳英偉王德信姜海靜唐志濤
    關(guān)鍵詞:木糖發(fā)酵液轉(zhuǎn)化率

    李力群,陳英偉,王德信,姜海靜,唐志濤

    (1.吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,吉林 吉林132022;2.吉林沱牌農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司 技術(shù)部,吉林 吉林132000)

    生物資源是地球上最豐富的可再生資源.隨著礦產(chǎn)資源日漸枯竭,開發(fā)高效轉(zhuǎn)化可再生纖維素物質(zhì)的微生物技術(shù),煉制生物燃料,具有極其重要的意義和廣闊的發(fā)展前景.我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的各種秸稈,每年約有7億噸.在玉米秸稈等植物纖維水解液中木糖約占25% ~30%,木糖的充分利用是植物纖維資源生產(chǎn)酒精經(jīng)濟(jì)可行性的關(guān)鍵之一[1].將木糖轉(zhuǎn)化為酒精,在理論上可提高酒精產(chǎn)量25%[2],因此選育優(yōu)良的木糖發(fā)酵酒精菌種勢(shì)在必行.

    本文從土壤中篩選出了可發(fā)酵木糖為酒精的菌株M-12#,對(duì)其進(jìn)行了初步研究,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ).

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 土樣

    分別采自吉林市九站經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)農(nóng)田和吉林化工學(xué)院校園.

    1.1.2 培養(yǎng)基

    YEPD液體培養(yǎng)基:酵母粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,木糖 20 g/L,蒸餾水1 L,pH 為 5.0,120 ℃滅菌30 min.

    YEPD固體培養(yǎng)基:酵母粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,木糖20 g/L,瓊脂粉20 g/L,蒸餾水1 L,pH為5.0,120℃滅菌30 min.

    發(fā)酵培養(yǎng)基:木糖20 g/L,酵母粉10 g/L,蛋白胨 15 g/L,(NH4)2SO41 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,CaCl2·2H2O 1 g/L,H2O 1 L,120℃滅菌30 min.

    1.1.3 主要儀器、試劑和測(cè)定方法

    主要儀器和設(shè)備 YP-600型精密電子天平,UV-2000型紫外可見光分光光度計(jì),生化培養(yǎng)箱,高壓蒸汽滅菌鍋,SW-CJ-2F型生物超凈工作臺(tái),HYG-A型回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜,SA23031型數(shù)碼生物顯微分析系統(tǒng)等.

    主要試劑酵母浸粉,蛋白胨,木糖,瓊脂粉、酵母膏、磷酸二氫鉀、尿素、硫酸鎂等試劑.

    主要測(cè)定方法酒精含量測(cè)定采用重鉻酸鉀比色法[5].木糖含量測(cè)定采用直接滴定法.生物量的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和比濁法,在比濁法中,將發(fā)酵液混合均勻后稀釋至一定倍數(shù),測(cè)定其吸光度OD600.

    2 實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 木糖發(fā)酵酒精菌株的篩選

    2.1.1 菌種初篩

    取10 g土樣加入到裝有90 mL帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中,震蕩30 min,吸取5份10 mL懸濁液分別加入至90 mL YEPD液體培養(yǎng)基中放置搖床培養(yǎng)48 h,搖速140 r/min,溫度30℃.富集后的菌液依次稀釋至10-6、10-7、10-8濃度,每個(gè)稀釋度吸取1 mL菌液均勻涂布到Y(jié)EPD固體平板上,30℃培養(yǎng)48 h,對(duì)長出的菌落,進(jìn)行復(fù)篩.

    2.1.2 菌種復(fù)篩

    TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)上層培養(yǎng)基:TTC 0.05 g,木糖0.5 g,瓊脂1.5 g,H2O 100 mL.

    TTC下層培養(yǎng)基:木糖10.1 g,蛋白胨2 g,酵母膏1.5 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,檸檬酸 0.27 g,瓊脂 20 g,H2O 1 L[3].

    將純化的菌株接入到TTC下層培養(yǎng)基平板,30℃倒置培養(yǎng)兩天,在長出的菌落上倒入TTC上層培養(yǎng)基覆蓋,于30℃下避光保存3 h,根據(jù)不同的菌落顏色等差異進(jìn)行篩選[4].

    將篩選出來的菌株接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在30℃、120 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵,48 h后挑出酒精濃度高的搖瓶,將菌液稀釋到相應(yīng)的濃度,重復(fù)TTC法篩選,經(jīng)過不斷的發(fā)酵馴化和篩選,選育出酒精產(chǎn)量高的菌落.

    2.2 菌種鑒定

    經(jīng)過復(fù)篩得到的菌株形態(tài)學(xué)特征:菌落質(zhì)地均勻,正反面和邊緣、中央部位的顏色均一,乳白色,表面光滑,容易挑起,不透明.液體培養(yǎng)形成菌膜和沉淀,細(xì)胞形態(tài)為卵圓柱形,主要以出芽方式繁殖,形成假菌絲,初步鑒定為霉菌,見圖1~2.

    圖1 菌株形態(tài)

    圖2 菌落形態(tài)

    2.3 生長曲線的測(cè)定

    將菌株接入不同濃度木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28℃,120 r/min條件下培養(yǎng).利用血球計(jì)數(shù)板法和濁度法測(cè)定霉菌濃度.使用UV-2000型紫外可見光分光光度計(jì),以滅菌的培養(yǎng)基為空白,比色皿厚度為5 mm,測(cè)定樣品的OD600值 (注:空白與樣品的稀釋倍數(shù)一致).菌株的生長曲線測(cè)定結(jié)果見圖3.

    圖3 菌株在不同木糖濃度培養(yǎng)基中的生長曲線

    圖3中的曲線表明,木糖濃度變化對(duì)霉菌的生長速度有明顯的影響.

    2.4 木糖發(fā)酵菌株的馴化

    將菌株接種到木糖濃度30 g/L的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度28℃,搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min條件下培養(yǎng)96 h.將TTC法篩選出發(fā)酵性能較高的菌株,再次接入木糖質(zhì)量濃度為30 g/L的液體培養(yǎng)基中,同樣條件下連續(xù)培養(yǎng)96 h.經(jīng)過不斷的發(fā)酵馴化和TTC方法篩選過程,不斷提高菌株的木糖發(fā)酵酒精能力和發(fā)酵效率.

    2.5 木糖發(fā)酵酒精性能實(shí)驗(yàn)

    發(fā)酵培養(yǎng)基木糖濃度分別為20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L.250 mL 三角瓶中裝量為100 mL.接種量為2 mL,pH 5.5,28℃,120 r/min搖床培養(yǎng),每隔24 h測(cè)一次酒精度和殘?zhí)橇?測(cè)實(shí)結(jié)果如圖4~5所示.

    圖4 菌株木糖發(fā)酵酒精性能曲線

    圖5 菌株木糖發(fā)酵酒精時(shí)殘?zhí)橇孔兓€

    圖5曲線趨勢(shì)表明,當(dāng)發(fā)酵液中的木糖濃度不高于3%時(shí),殘?zhí)橇枯^少,當(dāng)木糖濃度高于3%時(shí),殘?zhí)橇颗c木糖濃度成正比.

    其中木糖濃度30 g/L實(shí)驗(yàn)產(chǎn)酒精最多,其主要數(shù)據(jù)列于表1.

    表1 木糖30 g/L時(shí)菌株酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

    表1數(shù)據(jù)表明,當(dāng)發(fā)酵至120 h時(shí),酒精度達(dá)到峰值,為0.147%(v/v),木糖轉(zhuǎn)化率為0.045 g/g,為理論轉(zhuǎn)化率的9.85%.

    2.6 主要影響因素的探索實(shí)驗(yàn)

    2.6.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    分別以木糖濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵液pH值初值為影響因子,設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),探索影響酒精發(fā)酵的主要因素之間的關(guān)系,因素和水平的設(shè)計(jì)見表2.

    表2 因素水平設(shè)計(jì)表

    2.6.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

    按實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)要求,每個(gè)實(shí)驗(yàn)有五個(gè)平行發(fā)酵培養(yǎng)基瓶,115℃下滅菌30 min.然后接入菌種進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),測(cè)定不同時(shí)間的殘?zhí)橇亢途凭?,?shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6.

    圖6 菌株木糖發(fā)酵酒精正交實(shí)驗(yàn)曲線

    2.6.3 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

    采用直觀分析法處理對(duì)圖5中的酒精發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析,得到各因素的極差值:RA=1.908 7,RB=0.284 7,RC=0.078 5.通過比較極差數(shù)值的大小可知,最終影響霉菌木糖發(fā)酵酒精因素的強(qiáng)弱順序?yàn)?

    A(木糖濃度)>B(發(fā)酵溫度)>C(發(fā)酵液pH初值).各因素的R值差異表明:木糖濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最大,木糖濃度過高時(shí)有將產(chǎn)生嚴(yán)重的底物抑制;發(fā)酵溫度的影響次之,而發(fā)酵液pH初值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響相對(duì)最小.

    2.7 選育后的菌株發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)

    采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菌株的木糖發(fā)酵酒精工藝條件,因素和水平設(shè)計(jì)列于表3.

    表3 因素和水平設(shè)計(jì)表

    發(fā)酵溫度:28℃;發(fā)酵時(shí)間:66 h;搖床速度:145 r/min;木糖3%,酵母膏0.1%,磷酸二氫鉀0.05%,無水氯化鈣0.025%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4.

    表4中實(shí)驗(yàn)4的發(fā)酵酒份最高,達(dá)到0.48%(v/v),殘?zhí)?1.8%,搖瓶裝量:90 mL/250 mL.木糖轉(zhuǎn)化率為 0.316 g/g,達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的68.6%.

    表4 馴化后菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)

    3 結(jié) 論

    本工作從土壤是篩選得到了一株霉菌M-12#,其主要性能如下:

    (1)該霉菌的菌落呈白色,邊緣有缺刻,隆起,表面絲狀向外散射,在顯微鏡下的菌株呈短粗桿狀或棒狀,兩端比較圓滑.

    (2)在馴化之前,當(dāng)木糖濃度為30 g/L,發(fā)酵120 h,發(fā)酵酒精度達(dá)到峰值,為0.147%(v/v),木糖轉(zhuǎn)化率為0.045 g/g,為理論轉(zhuǎn)化率的9.85%.

    (3)經(jīng)過二個(gè)月地不斷馴化,篩選出來的菌株在木糖濃度為30 g/L的發(fā)酵液中,發(fā)酵66 h,酒精濃度提高了226%,達(dá)到0.48%(v/v),轉(zhuǎn)化率為0.316 g/g,為理論轉(zhuǎn)化率的68.6%.

    [1]Rodney JB,NancyN,Brace SD.Fermentations with new recombinant organisms [J].Biotechnol.Prog,1999(15):867-875.

    [2]曹秀華,阮奇城,林海紅,等.纖維燃料酒精生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展,中國麻業(yè)科學(xué)[J].2010,32(3):166-169.

    [3]祖若夫,胡寶龍,周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].上海:復(fù)旦大學(xué)出版社,1993.

    [4]王梅,張澎湃,帥桂蘭.TTC在黃酒酵母選育中的應(yīng)用[J].釀酒,2001(5):62-64.

    [5]林仁權(quán),胡文蘭,陳國亮.重鉻酸鉀氧化分光光度法測(cè)定酒中酒精含量[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,18(3):78-79.

    [6]杜連祥.工業(yè)微生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)[M].天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社.1992,10.

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