帶菌砧木種子和灌溉方式對西瓜嫁接苗細菌性果斑?。˙ F B）發(fā)生的影響

牛慶偉，蔣薇，孔秋生，黃遠，別之龍

（園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢，430070）

西瓜細菌性果斑病是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenaesubsp.citrulli）引起的瓜類細菌性果腐病，簡稱BFB，該病是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害，也是我國規(guī)定的檢疫性病害之一。該病最早于1969年由Crall和Schenck[1]在美國佛羅里達州發(fā)現(xiàn)，我國1985年發(fā)現(xiàn)并開始報道瓜類BFB的發(fā)生和為害[2～4]。BFB病菌寄主主要有西瓜、羅馬甜瓜、蜜露洋香瓜和網(wǎng)紋洋香瓜等，采用人工接種的方式其也可以感染其他葫蘆科作物，如黃瓜、甜瓜、節(jié)瓜、瓠瓜、南瓜、絲瓜、苦瓜、西葫蘆等[5]。BFB病菌主要附著在種子和病株殘體上越冬，種子帶菌為主要初侵染源，病菌隨風、雨或灌溉水從植株氣孔或傷口侵入，病菌在病株上大量繁殖擴展，造成再次侵染[6]。

近年來，越來越多的育苗工廠出現(xiàn)BFB的發(fā)生與流行，導(dǎo)致經(jīng)濟損失嚴重。但到目前為止，對于BFB還沒有一種可以徹底控制的方法。研究BFB在西瓜嫁接育苗過程中的發(fā)生規(guī)律對防控西瓜BFB的發(fā)生與流行具有重要意義。研究表明，在西瓜嫁接育苗過程中帶菌接穗種子、帶菌育苗基質(zhì)和帶菌嫁接用具均能導(dǎo)致嫁接苗BFB的發(fā)生[7～9]。帶菌砧木種子、灌溉方式對西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的影響如何，目前尚不知曉。Bahar等[10]通過試驗證明BFB病菌能夠通過木質(zhì)部導(dǎo)管向下和向上移動從而系統(tǒng)侵染甜瓜幼苗。本研究對西瓜砧木種子人工接菌，采用發(fā)病砧木幼苗與健康接穗幼苗為嫁接材料，初步探索BFB病菌在嫁接苗上的侵染途徑，研究帶菌砧木種子與西瓜嫁接苗BFB發(fā)生間的關(guān)系。曾義安等[11]曾指出土傳病害枯萎病、非土傳病害病毒病、霜霉病和灰霉病在嫁接植株上的病情指數(shù)和發(fā)病率均低于自根植株。本研究采用人工噴霧接種的方法鑒定不同類型嫁接苗對BFB的抗性。趙廷昌等[5]曾指出在溫室中，由于人工灌溉等原因，可使BFB病菌自然接種到同株葉片或鄰近的幼苗上，帶病幼苗移入田后，借雨水或噴灌水而傳播感染。本研究明確了不同灌溉方式與嫁接苗BFB發(fā)生間的關(guān)系，提出了有利于控制病害的灌溉方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試砧木品種為京欣砧一號，購自北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心。供試接穗品種為早佳“84-24”，購自新疆明鑫科鴻農(nóng)業(yè)科技有限責任公司。育苗基質(zhì)為草炭∶珍珠巖=2∶1（體積比）。西瓜BFB病菌為pslbtw20，該病原菌屬于Aac，由中國農(nóng)科院植保所趙廷昌研究員惠贈。

供試培養(yǎng)基為KBA培養(yǎng)基：硫酸鎂1.5 g、磷酸氫二鉀 1.5 g、瓊脂 20 g、甘油 10 g、蛋白胨 20 g、蒸餾水 1 000 mL、pH 值 7.0～7.2。

1.2 試驗方法

①葉片發(fā)病情況分級標準和病情指數(shù)計算 葉片發(fā)病情況分級標準參考Hopkins等[12]的方法，0級：無病；1級：葉片病斑較少，病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級：病斑較多，病斑面積占整個面積的5%～30%；5級：病斑較多，病斑面積占整個面積的30%～50%；7級：病斑很多或融合成大斑，病斑面積占整個面積的50%以上，葉片未焦枯死亡；9級：病斑很多或融合成大斑，病斑面積占整個面積的50%以上，常使葉片焦枯死亡。

病情指數(shù)參考翟艷霞[13]的計算公式：病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值）×100。

②試驗地點 試驗在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室和國家蔬菜改良中心華中分中心連棟玻璃溫室內(nèi)進行。

③砧木種子接菌方法的篩選 挑選西瓜BFB病菌pslbtw20的單菌落，采用KBA液體培養(yǎng)基對西瓜BFB病菌進行培養(yǎng) （28℃，220 r/min）， 使菌液OD600值達到 0.3～0.4（濃度約為 108cfu/mL），梯度稀釋濃度分別為 107cfu/mL、105cfu/mL、103cfu/mL的菌液。種子接菌參考馮建軍等[14]的浸種法并進行改進，按1 g砧木種子與2 mL不同濃度菌懸液的比例浸泡，分別振蕩 30、60 min（25℃、160 r/min），取出后于超凈工作臺晾干備用。帶菌種子浸種催芽后播種，置于25℃、RH 70%的人工氣候箱中培養(yǎng)，共6個處理，每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)50粒砧木種子。待砧木適合嫁接時統(tǒng)計砧木幼苗的發(fā)病率和子葉病斑面積＜5%的發(fā)病砧木幼苗株數(shù)。

④帶菌砧木種子與西瓜嫁接苗BFB發(fā)生間的關(guān)系 將1 000粒砧木種子按1 g種子與2 mL 105cfu/mL菌懸液的比例浸泡，振蕩30 min（25℃、160 r/min），于超凈工作臺過夜晾干。帶菌種子浸種催芽后播種，置于25℃、RH 70%的人工氣候箱中培養(yǎng)，6 d后培育西瓜接穗幼苗。待砧木適合嫁接時，選擇子葉病斑面積為5%左右的砧木幼苗，以無菌砧木幼苗為對照，采用頂插接和斷根插接的方法嫁接[15]，每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)20株。每天調(diào)查嫁接苗的發(fā)病癥狀，并統(tǒng)計發(fā)病率。

⑤不同類型西瓜嫁接苗對BFB的抗性鑒定采用斷根和頂插接兩種方法嫁接[15]，研究斷根嫁接苗和頂插接苗對BFB的抗性，以自根苗作為對照。試驗在玻璃溫室內(nèi)進行，幼苗3葉1心期，采用pslbtw20菌懸液（108cfu/mL）噴霧法接種，薄膜保濕48 h，每個處理30株，3次重復(fù)。3 d后調(diào)查葉片的發(fā)病情況，第8天統(tǒng)計各處理病情指數(shù)。參考田英等[16]的相對抗病性方法評價嫁接苗的抗病程度，抗病程度分為免疫（I）、高抗（HR）、中抗（MR）、中感（MS）、感?。⊿）5 類，相對抗病指數(shù)分別為 1.00、0.80～0.99、0.40～0.79、0.20～0.39 和 0.20 以下。相對抗病指數(shù)=1-相對病情指數(shù)。相對病情指數(shù)=鑒定嫁接苗平均病情指數(shù)/對照自根苗平均病情指數(shù)。

⑥不同灌溉方式對西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的影響 2葉1心期，嫁接苗噴霧接菌，第4天挑選病情指數(shù)相近的發(fā)病嫁接苗作為初侵染病株，移栽至健康嫁接苗群體，初侵染病株在穴盤中的分布位置如圖1所示，灰色為初侵染病株的位置，白色為健康嫁接苗的位置，初始發(fā)病率分別設(shè)置為0%、4%、12%和20%。試驗在人工氣候室內(nèi)進行，采用不同的灌溉方式提供水分，試驗設(shè)計如表1所示，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)8個處理，3次重復(fù)，每重復(fù)種植一穴盤。9月5日進行第一次灌溉處理，以后每隔2 d灌溉一次，每次灌溉前統(tǒng)計穴盤內(nèi)嫁接苗的發(fā)病率，9月15日試驗結(jié)束。分別于試驗開始時（9月5日）和試驗結(jié)束時（9月15日）統(tǒng)計初侵染病株的病情指數(shù)，計算BFB日增長速率。

圖1 初侵染病株在穴盤中的分布位置

病 害 日 增 長 速 率 的 計 算 公 式[17]：r=1/（t2-t1）×ln[X2（1-X1）/X1（1-X2）]。式中：r 為病害日增長率；X1為前1次調(diào)查的病情指數(shù)；X2為后1次調(diào)查的病情指數(shù)；t2-t1為2次調(diào)查之間的時間距。

2 結(jié)果與分析

2.1 砧木種子接菌方法的篩選

由表2可知，砧木種子接菌濃度越高、時間越長，幼苗發(fā)病率越高。 107cfu/mL（30 min、60 min）處理下，砧木發(fā)病情況嚴重，不存在可以嫁接的砧木幼苗；105cfu/mL（30 min）處理下，50 株砧木幼苗中有7株可以嫁接的發(fā)病砧木幼苗，能夠獲得更多適合嫁接的帶菌砧木幼苗。試驗采用砧木種子的接菌方法為：按1 g砧木種子與2 mL 105cfu/mL菌懸液的比例浸泡，振蕩 30 min（25℃、160 r/min），超凈工作臺過夜晾干。砧木種子人工接種試驗表明，帶菌砧木種子能夠?qū)е抡枘居酌鏐FB的發(fā)生，帶菌砧木種子播種出苗后，果斑病病菌開始于子葉發(fā)病，子葉背面出現(xiàn)水漬狀病斑，隨著幼苗的生長，發(fā)病嚴重的砧木幼苗，病斑逐漸向葉基部侵染，并侵染莖部，最終砧木腐爛死亡。

2.2 帶菌砧木種子對西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的影響

表2 砧木種子接菌方法的篩選

砧木種子帶菌導(dǎo)致砧木幼苗BFB的發(fā)生，選擇幼苗子葉病斑面積為5%左右的砧木幼苗和無菌接穗幼苗，采用頂插接和斷根嫁接的方法嫁接。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嫁接苗BFB發(fā)病率100%，砧木上的BFB病菌均可侵染至接穗（圖2），隨著病情發(fā)展，接穗子葉腐爛壞死，最終整株嫁接苗腐爛死亡?？梢姡枘痉N子帶菌后BFB病菌通過嫁接傳遞可導(dǎo)致嫁接苗BFB的發(fā)生，不同嫁接方法與BFB的發(fā)生無顯著差異。

2.3 不同類型的西瓜嫁接苗對BFB的抗性鑒定

BFB病菌接種于不同類型的西瓜嫁接苗，幼苗從第3天開始發(fā)病，病葉初期呈現(xiàn)少量水浸狀病斑，呈不規(guī)則形，暗青色，水浸狀病斑通常沿葉脈發(fā)展，中期病斑由暗青色至暗棕色，嚴重時，沿葉脈發(fā)展到葉基部，葉片焦枯死亡。第8天進行相對抗病性分析，自根苗、頂插接苗和斷根嫁接苗的病情指數(shù)分別為 73.1、67.9 和 71.4（圖 3），頂插接苗和斷根嫁接苗的相對抗病指數(shù)分別為0.07和0.02，均為感病類型?？梢?，嫁接苗和自根苗在苗期對于BFB的抗性沒有差異，嫁接不能提高西瓜對BFB的抗病性。

2.4 不同灌溉方式對嫁接苗BFB發(fā)病率的影響

由圖 4可知，A1、B1（對照）處理嫁接苗 BFB發(fā)病率為0。A2、A3、A4的發(fā)病率從第4天開始不斷增加，B2、B3和B4發(fā)病率基本穩(wěn)定不變。 第 10天，B2、B3、B4、A2、A3和 A4的 發(fā) 病 率 分 別 增 加 了 0.7、0.7、0.7、3.3、7.3 和 12 個百分點。 采用上部噴灌的方式有利于細菌性果斑病的傳播，而且初侵染源越多病害傳播的規(guī)模就越大。

2.5 不同灌溉方式對初侵染病株病情擴展的影響

由表 3 可知，試驗開始時 A2、A3、A4、B2、B3和 B4初始病情指數(shù)無顯著差異，試驗結(jié)束時A2、A3、A4的病情指數(shù)顯著高于B2、B3、B4的。病情指數(shù)的日增長率為 A2＞A3＞A4＞B2＞B4＞B3。 由此可見，采用上部噴灌方式提供水分，發(fā)病植株病情指數(shù)迅速提高，能夠加速病情的惡化，潮汐灌溉能夠減緩病害的擴展。

3 結(jié)論與討論

BFB為害在我國各西瓜產(chǎn)區(qū)均有報道，接穗種子帶菌是導(dǎo)致嫁接苗感染BFB的主要原因，帶有BFB的西瓜種子經(jīng)西瓜嫁接苗育苗場造成的毀苗率高達 30%～80%[18，19]。 本研究結(jié)果表明，在西瓜嫁接育苗過程中，砧木種子接菌濃度從103～107cfu/mL均可造成砧木幼苗BFB的發(fā)生，濃度越大發(fā)病率越高。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，砧木種子帶菌后通過系統(tǒng)侵染會導(dǎo)致砧木幼苗BFB的發(fā)生，以發(fā)病砧木幼苗和健康接穗幼苗為嫁接材料，BFB病菌通過嫁接傳遞可導(dǎo)致嫁接苗BFB的發(fā)生，表明砧木種子可能成為西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的來源。Tian等報道2012年7月在安徽省發(fā)現(xiàn)因南瓜砧木種子帶菌導(dǎo)致西瓜嫁接苗BFB的發(fā)生現(xiàn)象。閻莎莎等[20]指出Aac有單根極生鞭毛，其鞭毛在侵染過程中有重要的作用，IV型菌毛可幫助病菌定殖和在維管束導(dǎo)管中移動。由此推測，砧木上BFB病菌可能通過木質(zhì)部導(dǎo)管侵染至接穗。

圖2 砧木幼苗發(fā)病時BFB病菌從砧木侵染至接穗的癥狀

圖3 不同類型嫁接苗人工噴霧接種后的病情指數(shù)比較

圖4 不同處理對嫁接苗BFB發(fā)病率的影響

劉龍洲等[21]在甜瓜嫁接育苗實踐中發(fā)現(xiàn)，對于白粉?。鈧魅~部病害）而言，以商業(yè)甜瓜品種為接穗，部分甜瓜材料為砧木，嫁接苗比自根苗的抗性強。張繼梅等[22]指出，嫁接可以有效防治枯萎病的發(fā)生，而且嫁接后西瓜苗的葉部病害抗性能力顯著增強。BFB雖然是一種細菌性種傳病害，但是該病菌可侵染葫蘆科作物葉片，引起葉部病害，本研究鑒定了嫁接苗對BFB的抗性水平，結(jié)果表明，嫁接苗和自根苗在苗期對BFB的抗性沒有差異，嫁接沒有提高西瓜苗對BFB的抗性。Silva等[23]指出BFB病菌可以侵染甜瓜葉片，而且優(yōu)先定殖于葉片的毛狀體基部、氣孔的邊緣和表皮細胞間隙。韓曉燕[24]指出利用抗病砧木進行嫁接可以增強蔬菜作物對多種病害的抗性，但砧木對所抗病害的種類有一定的選擇性。由此可知，嫁接苗和自根苗對BFB抗性無顯著差異可能與嫁接苗葉片結(jié)構(gòu)、砧木對BFB的抗性和BFB病菌的侵染特性有關(guān)。目前，還沒有發(fā)現(xiàn)BFB的抗性砧木，在嫁接育苗過程中避免菌源的進入對于嫁接苗BFB的防治至關(guān)重要。

上部噴灌是工廠化育苗過程中常用的灌溉方式之一，但采用上部噴灌容易造成溫室內(nèi)高濕的環(huán)境條件，利于病蟲害的發(fā)生和擴展。當前，BFB已成為威脅嫁接苗生產(chǎn)的主要病害，BFB病菌通過上部噴灌的方式在嫁接育苗場內(nèi)不斷傳播與擴展，給嫁接育苗場造成了巨大的經(jīng)濟損失，急需一種科學(xué)、合理、防病的灌溉方式。楊仁全等[25]指出潮汐灌溉是針對容器育苗所設(shè)計的底部給水的灌溉方式，潮汐灌溉使棚內(nèi)相對濕度容易控制，可保持作物葉面干燥，是一種節(jié)能、環(huán)保、高效的灌溉技術(shù)。本研究結(jié)果表明，與潮汐灌溉相比，采用上部噴灌的方式有利于BFB的傳播，而且初侵染源越多，病害傳播的規(guī)模越大，發(fā)病植株病情惡化迅速，采用潮汐灌溉可有效地控制BFB的發(fā)生與擴展。

在西瓜嫁接育苗過程中，砧木種子帶菌后通過嫁接傳遞可導(dǎo)致嫁接苗BFB的發(fā)生，不同嫁接方法對BFB的發(fā)生無顯著差異。與上部噴灌相比，潮汐灌溉能有效地控制嫁接苗BFB的發(fā)生。

表3 初侵染病株病情指數(shù)及其日增長率

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