金針菇液體菌種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

徐學(xué)鋒，沈敏，譚明艷，陳小燕

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州，510642）

金針菇（Flammulina velutipes）是一種優(yōu)質(zhì)食用菌，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦質(zhì)元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]，以及樸菇素（Flammutn）、蒜菇素、金針菇原素（Flamn）等功能活性成分，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、促進(jìn)智力發(fā)育、護(hù)肝等作用[2]，早已成為人們熟知的保健食品。隨著技術(shù)的革新和國內(nèi)外市場(chǎng)需求的增長，金針菇生產(chǎn)方式已由傳統(tǒng)作坊式、季節(jié)性生產(chǎn)，向設(shè)施化、工廠化生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變[3]。作為金針菇工廠化栽培的關(guān)鍵技術(shù)之一，液體菌種具有生產(chǎn)周期短、接種便利、菌絲分散性好、萌發(fā)點(diǎn)多、生長快、成品率高等優(yōu)點(diǎn)，液體菌種的應(yīng)用已成為食用菌菌種及規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)[4]。本研究采用液體搖瓶培養(yǎng)，對(duì)金針菇液體菌種的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為金針菇栽培技術(shù)的提升提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

金針菇21，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 培養(yǎng)基

①碳源篩選培養(yǎng)基 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，維生素 B11 mg/L）中，分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉4種碳源，121～126℃滅菌20 min，冷卻備用。

②氮源篩選培養(yǎng)基 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，維生素 B11 mg/L）中，分別加入2%的蛋白胨、酵母膏、麩皮3種氮源，滅菌，備用。

③培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基 玉米粉2%、麩皮1%、酵母粉0.5%、葡萄糖1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、CaCO30.2%、維生素 B11 mg/L。

④固體菌種培養(yǎng)基 小麥98%、白糖1%、石膏1%。小麥在清水中浸泡6～8 h，吸足水分，然后煮熟（不開粒），撈出瀝干水，加入石膏粉、白糖拌勻，分裝瓶中，滅菌，備用。

⑤栽培培養(yǎng)基 棉籽殼培養(yǎng)基（干料）：棉籽殼78%、麩皮20%、蔗糖1%、CaCO31%，加水?dāng)嚢柚梁?0%，裝袋（每袋折合干料300 g），滅菌，冷卻待用。

1.3 菌種活化

菌種斜面接種到PDA平板，25℃恒溫培養(yǎng)8 d，備用。

1.4 碳源、氮源的篩選

每種不同培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)，用直徑0.2 cm的打孔器在活化的菌種平板上打孔，搖瓶容量250 mL，裝液量70 mL，接活化菌種5塊，25℃靜置24 h后，150 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d，觀察菌絲球形態(tài)，測(cè)定菌絲體生物量。

1.5 菌絲體生物量測(cè)定

取50 mL搖勻的培養(yǎng)液，過濾收集菌絲，蒸餾水洗滌至水變清后，將菌絲球置于恒重過的定性濾紙之上，于干燥箱60℃烘至恒重后稱量[5]。

1.6 液體菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化

①一級(jí)種子的制備 將PDA活化的菌種經(jīng)打孔后接種到液體培養(yǎng)基，恒溫25℃，150 r/min條件下培養(yǎng)2 d，作為種子備用。

②搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化 三角瓶容量250 mL，接種上述種子液進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，根據(jù)已有報(bào)道[5～7]，以搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量及培養(yǎng)溫度為4個(gè)因素，采用 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，詳見表 1，共培養(yǎng)5 d，以菌絲體生物量為考察指標(biāo)，進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，獲得最佳搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件。

1.7 最佳接種菌齡的確定

發(fā)酵培養(yǎng)基在最優(yōu)條件下制備液體菌種，菌齡分別設(shè)4、5、6 d三組，經(jīng)輕微絞碎后，接種到棉籽殼培養(yǎng)基，每組20袋，觀察菌絲長滿所耗的時(shí)間及菌絲的生長狀況。

1.8 固體菌種的制備

將活化好的PDA菌種平板接種到麥粒菌種培養(yǎng)基，在25℃、相對(duì)濕度75%左右條件下培養(yǎng)至滿袋后，繼續(xù)培養(yǎng)1周，待用。

1.9 出菇試驗(yàn)

分別將固體和液體菌種 （菌齡5 d）接種10 g（或10 mL）到棉籽殼培養(yǎng)基中，各50袋，24℃、相對(duì)濕度75%左右條件下培養(yǎng)至滿袋，繼續(xù)1周后轉(zhuǎn)入13～14℃菇房，相對(duì)濕度 85%～90%，出菇兩茬[8]，記錄長滿、現(xiàn)蕾時(shí)間及鮮菇產(chǎn)量，計(jì)算生物學(xué)效率，生物學(xué)效率（%）=子實(shí)體鮮質(zhì)量/培養(yǎng)基干質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)金針菇菌絲體生長的影響

表1 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 不同碳源對(duì)金針菇21菌絲體生長的影響

以不同碳源進(jìn)行金針菇液體培養(yǎng)均能收獲菌絲，但所得菌絲干質(zhì)量差異較大（表2）。葡萄糖和蔗糖產(chǎn)生的菌絲體較少，分別只有1.136 2和1.051 1 g/100 mL，而天然性的碳源玉米粉和可溶性淀粉產(chǎn)生的菌絲體干質(zhì)量較大，最多達(dá)1.630 5 g/100 mL，菌絲球的形態(tài)也較優(yōu)。分析原因可能是天然成分中含有有利于菌絲生長的生長因子，而葡萄糖可能具有碳代謝抑制效應(yīng)，形成反饋抑制作用，不利于碳源的吸收與利用。

2.2 不同氮源對(duì)金針菇菌絲體生長的影響

3種氮源中，NH4NO3組獲得的菌絲干質(zhì)量最少，只有0.631 2 g/100 mL，說明NH4NO3被真菌菌絲利用得很少，在栽培過程中添加NH4NO3的意義也不大；蛋白胨作為一種半人工氮源，促進(jìn)金針菇生長的作用表現(xiàn)一般；麩皮組中菌絲的得率最高，達(dá)1.531 9 g/100 mL，菌絲球的形態(tài)也最好，這與現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中常以麩皮作為輔助材料是一致的（表3）。

2.3 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

①正交試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度4因素3水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表4。極差分析表明，A>D>C>B，說明搖床轉(zhuǎn)速對(duì)液體菌種的菌體生長影響最大，其次為培養(yǎng)溫度，再次為種子液的接種量，裝液量對(duì)菌絲得率的影響最小。

理論最優(yōu)的培養(yǎng)條件為A2B2C3D2，即搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量 60 mL、接種量 12%、培養(yǎng)溫度22℃。

表3 不同氮源對(duì)金針菇21菌絲體生長的影響

表4 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

②驗(yàn)證性試驗(yàn) 為了進(jìn)一步檢驗(yàn)正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，按上述最優(yōu)培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)菌絲球大小較均勻，濃度高，密度較大，經(jīng)測(cè)定所得菌絲干質(zhì)量為1.821 5 g/100 mL。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下進(jìn)行菌種液體培養(yǎng)具有較好的重復(fù)性，說明正交試驗(yàn)結(jié)果是可信的。

2.4 液體菌種的應(yīng)用

①最佳菌齡的確定 分別將經(jīng)過4、5、6 d發(fā)酵的液體菌種接種到棉籽殼培養(yǎng)基上后，滿袋天數(shù)分別為27、25、28 d，其中發(fā)酵5 d的菌種滿袋所需時(shí)間最短，菌絲健壯，長勢(shì)旺。

②出菇試驗(yàn)結(jié)果 栽培試驗(yàn)中2種不同菌種接種的菌袋出菇過程的相關(guān)記錄見表5。液體菌種栽培袋長滿時(shí)間要比固體菌種提早9 d，頭潮菇采收早7 d，二潮菇早9 d，總產(chǎn)量約高出5.8%。

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)不同碳源和氮源進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)以玉米粉為碳源、麩皮為氮源制備金針菇21菌株液態(tài)菌種的效果較好。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量60 mL（三角瓶，250 mL容量）、接種量12%、培養(yǎng)溫度22℃時(shí)所得液體菌種質(zhì)量最優(yōu)，菌絲干質(zhì)量達(dá)1.821 5 g/100 mL。該條件下生產(chǎn)的液體菌種在出菇試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)菌絲的生長時(shí)間、出菇時(shí)間都相應(yīng)提前，有效地縮短了生產(chǎn)周期，并且產(chǎn)量有所提高。

碳源和氮源是食用菌最主要的營養(yǎng)物質(zhì)，它們幾乎參與細(xì)胞代謝一切的過程。金針菇能利用的碳源和氮源范圍很廣[9]，通常復(fù)合型的優(yōu)于單一型的，有機(jī)態(tài)優(yōu)于無機(jī)態(tài)。本試驗(yàn)篩選的結(jié)果顯示，較好的碳氮源分別是玉米粉和麩皮。除了碳、氮源等主要營養(yǎng)元素外，包括無機(jī)鹽、生長因子等其他營養(yǎng)成分對(duì)金針菇的生長發(fā)育的影響也十分明顯，不少研究者作了很多工作[5，9]。不同菌株特異性不同，所以在營養(yǎng)需求上略有差異，有必要從實(shí)驗(yàn)室研究[10]和栽培實(shí)踐[7，11]兩方面協(xié)同深入。

表5 液體和固體菌種出菇比較

液體菌種的培養(yǎng)條件中溫度是相對(duì)較為敏感的因素，有研究者發(fā)現(xiàn)25℃是金針菇液體菌種的最適培養(yǎng)溫度[6，11]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最適溫度為 22℃，與黃仁術(shù)[5]的結(jié)果一致。本試驗(yàn)優(yōu)化后的最優(yōu)轉(zhuǎn)速與陳力力等[6]和閆長偉等[7]的結(jié)果略有差異，極差分析顯示，轉(zhuǎn)速對(duì)菌種的影響最大，分析原因可能是正交設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)速差距較大造成的。搖瓶培養(yǎng)過程中，較高轉(zhuǎn)速通常會(huì)導(dǎo)致菌絲球過于緊密，限制其生長，從而影響菌絲生物量，相反，轉(zhuǎn)速過低又會(huì)影響營養(yǎng)物質(zhì)的傳導(dǎo)和溶氧量，不利于生物量的積累和菌絲活力的保持。目前，生產(chǎn)實(shí)踐中，多采用發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵，與搖瓶不同的是需要考察螺旋槳[11]對(duì)菌絲的剪切力和通氣量[10，12]等指標(biāo)，較搖瓶發(fā)酵更為精確。

由于出菇試驗(yàn)是小規(guī)模袋式栽培，管理過程中參數(shù)波動(dòng)幅度較大[13]，導(dǎo)致兩組試驗(yàn)總體的生物轉(zhuǎn)化率都偏低。另外，搖瓶發(fā)酵的液體菌種菌絲活力會(huì)略遜于液體深層發(fā)酵，使得液體菌種的優(yōu)勢(shì)發(fā)揮也不充分。所以，出菇試驗(yàn)的結(jié)果只是在一定程度上說明了液體菌種在栽培上有優(yōu)勢(shì)，在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用有待進(jìn)一步細(xì)致深入的分析。

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