PRRSV經(jīng)典株與變異株RT-PCR鑒別方法的建立及應用

俞建萍 翁燕梅 劉昌林

（1.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014；2.南昌市農(nóng)業(yè)科學院 南昌 330006）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱“豬無名高熱病”、“豬高熱綜合征”、“豬高熱征”，是20 世紀80年代末發(fā)現(xiàn)的一種傳染性疾病，能引起妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等生殖障礙，以及各種年齡豬（特別是仔豬）的呼吸道疾病［1］，具有傳播速度快、流行范圍廣、感染發(fā)病率高、治療效果較差、經(jīng)濟損失大等特點。該病于1987年初次暴發(fā)于美國［2-3］。隨后短短幾年時間內(nèi)，迅速遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)（北美洲，1987；歐洲，1990；亞洲，1991）［1-5］。國內(nèi)1996年郭寶清等［6］首次分離到PRRSV，并命名為CH-1a，從而證實該病存在于我國。現(xiàn)在幾乎所有的養(yǎng)豬國家都流行PRRSV［7-8］。試驗通過高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）Nsp2 基因的缺失信息，設(shè)計3條特異性引物，并優(yōu)化各種條件，建立了一種能夠鑒別診斷高致病性PRRSV和經(jīng)典PRRSV的RT-PCR 方法，能夠準確、快速地對養(yǎng)殖場提供PRRS 診斷，具有臨床實用性。

1 材料與方法

1.1 病料來源 PRRSV 臨床疑似病料均由江西農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)院提供，為病死豬的肺、淋巴結(jié)和肝臟等組織。

1.2 分子生物學試劑及主要藥品 PCR 擴增試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol、100 bpDNA Marker均購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司，RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司，氯仿、無水乙醇、異丙醇、醋酸鈉等其他試劑均為分析純試劑。

1.3 引物合成設(shè)計 根據(jù)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）Nsp2 基因的缺失信息，設(shè)計了3條（兩對）特異性引物（由上海生工合成）：P1-P3 引物對既能擴增PRRSV 經(jīng)典株又能擴增PRRSV 變異株；P2-P3 引物只能擴增PRRSV 變異株。

P1：TGTCCCAGCTCAGCGCAGCAAGC（上游引物）；

P2：GCCGTAGAACTGTGACAACAACG（上游引物）；

P3：CACAGGGAGCTGCTTGATGACAC（下游引物）。

1.4 方 法

1.4.1 病毒RNA的提取 將病死豬的腎臟、脾臟、淋巴結(jié)各取少量放入裝有PBS的玻璃勻漿器中進行磨碎，4 ℃，12 000 r/min 離心，棄上清，然后根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書進行操作提取RAN，最后加40μL DEPC 水溶解RNA，55～60 ℃溫育10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆没蛄⒓词褂谩?/p>

1.4.2 RT-PCR 反應

1.4.2.1 反轉(zhuǎn)錄體系（體積為20μL） 見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系表

按以上順序?qū)⑸鲜龇磻阂来渭尤氲紼P 管中，輕輕混勻。

1.4.2.2 反轉(zhuǎn)錄條件 42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min 失活TransScript RI，共一個循環(huán)，反應在PCR 擴增儀上進行。合成的cDNA 立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.3 PCR 反應組成（體積為50μL）見表2。

按表中順序?qū)⒎磻阂来渭尤氲絇CR 反應管中，輕輕混勻。

1.4.2.4 反應條件 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；最后一個循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物立即使用或4 ℃保存。

1.4.2.5 電泳條件 取8μL RT-PCR 擴增產(chǎn)物與少許上樣緩沖液充分混合，在80 伏電壓、40 毫安條件下電泳40 min 左右，于1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳然后在紫外線燈下觀察結(jié)果并拍照。

表2 PCR 反應體系

2 結(jié) 果

2.1 擴增結(jié)果檢測 如圖1 所示，PCR 擴增出的PRRS 經(jīng)典株目的基因大小529 bp 與預期大小相符，PRRS 變異株目的基因大小218 bp 與預期相符。

圖1 PRRSV的PCR 擴增結(jié)果

2.2 擴增片段的特異性鑒定 PCR 產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序，對所測序列進行同源性分析，由引物P1、P3 擴增的529 bp 左右基因序列與GenBank 中已發(fā)表的PRRSV 經(jīng)典株核酸序列同源性在93%以上；由引物P1、P3 擴增的439 bp 左右基因序列與GenBank 中已發(fā)表的高致病性PRRSV 核酸序列同源性在94%以上；由引物P2、P3 擴增的218 bp 左右基因序列與GenBank 中已發(fā)表的高致病性PRRSV 核酸序列同源性在94%以上。結(jié)果提示本試驗產(chǎn)物具有良好的特異性，該方法進行臨床組織病料中高致病性PRRSV和經(jīng)典PRRSV的檢測是可行的。

2.3 臨床病料中的檢測結(jié)果 283 份豬“豬高熱病”病料，分別收集于2009年2月份到2009年12月份，來自于南昌、宜春、九江、新余、吉安等地區(qū)的發(fā)病豬場（病料的具體情況見表3）。

表3 283 份病料基本情況

從表3 中可以看出，感染的陽性病料主要為單純PRRSV 變異株感染，共計163 份，占病料總數(shù)的57.60%。

2.4 部分病料檢測的電泳圖 部分病料檢測電泳結(jié)果如圖2和圖3 所示。

圖2 部分病料檢測的電泳圖

圖3 部分病料檢測的電泳圖

3 討論

用于PRRSV 診斷的方法主要有病毒的分離法、血清學方法（IFA、ELISA、IPMA、SN）和RT-PCR等方法［9］。血清學方法中IFA和ELISA 方法應用較廣泛，IFA 方法需要熒光顯微鏡且結(jié)果通過肉眼觀察，有一定的主觀性；ELISA 主要用于檢測抗體，血清學方法不能區(qū)分高致病性PRRSV和經(jīng)典PRRSV；病毒分離法是一種傳統(tǒng)的檢測方法，但病毒分離所需時間長，因此，病毒分離法不適合用于該病的快速診斷。

本試驗對幾十株P(guān)RRSV 經(jīng)典毒株和變異毒株的Nsp2 基因序列進行分析，根據(jù)PRRSV Nsp2 基因的缺失信息，設(shè)計了3條特異性引物，通過對PCR 體系中引物、dNTP 濃度、Mg2+濃度以及溫度、時間以及循環(huán)次數(shù)等條件進行優(yōu)化，建立了能夠鑒別診斷高致性PRRSV和經(jīng)典PRRSV的RT-PCR 方法。

近年來，部分省市和地區(qū)的生豬在高溫季節(jié)都不同程度地發(fā)生“豬高熱病”，該病特征是體溫升高至41 ℃以上，呈稽留熱，厭食、倦怠、皮膚發(fā)紅、呼吸急促等。多數(shù)病程長達7 d 以上，或反復發(fā)作，發(fā)病率和死亡率都較高，給豬養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟損失。為預防和控制該疾病的再次流行，保障養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，有必要了解臨床病例中PRRSV 經(jīng)典株和PRRSV 變異株的感染情況。從表3 中可以看出，在283 份病料中有204 份結(jié)果為PRRSV 陽性，陽性率72.08%。單純PRRSV 變異株感染163 份，占57.60%；PRRSV 經(jīng)典株與PRRSV 變異株混合感染39 份，占13.18%；單純PRRSV 經(jīng)典株感染僅為2 份，僅占0.71%。由此說明目前主要流行的還是高致病性PRRSV，PRRSV 變異株陽性率很高，可能與該病毒在豬群中的持續(xù)感染特性有關(guān)。感染中存在部分PRRSV 經(jīng)典株與PRRSV 變異株混合感染，但是單純的PRRSV 經(jīng)典株感染情況卻極其少，然而由于不能鑒定疫病中PRRSV 經(jīng)典株到底是野毒感染還是疫苗株，因此，不能推測出PRRSV 經(jīng)典株在“高熱病”中的致病地位。通過對臨床樣品的檢測表明該方法能夠準確地診斷高致病性PRRSV，且具有快速、敏感和特異的特點，具有臨床實用性。

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