2型豬鏈球菌與人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）黏附和侵襲作用的研究

葉淑超 福建省建甌市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局 353100

豬鏈球菌病是由溶血性鏈球菌引起的一種人畜共患病。根據(jù)溶血現(xiàn)象把鏈球菌分為α、β和γ型，并根據(jù)豬鏈球菌的莢膜多糖抗原特性的差異，將其分為35個血清型（1-34型和1/2型）。2型豬鏈球菌（SS2）是毒力最強(qiáng)的血清型之一。目前研究SS2致病機(jī)理主要集中在兩個方面。第一，通過黏附作用產(chǎn)生積液導(dǎo)致腦膜炎：當(dāng)SS2進(jìn)入體內(nèi)后，先黏附于扁桃體黏膜細(xì)胞表面，刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生巨噬細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。此時大量細(xì)胞因子生成，產(chǎn)生滲液。滲液最后積聚，使人出現(xiàn)典型腦膜炎癥狀。第二，對機(jī)體非特異性免疫產(chǎn)生破壞作用：當(dāng)SS2侵襲脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞時，預(yù)示著該菌開始破壞血腦脊液屏障。脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞是血腦屏障結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而不同菌株對該屏障破壞作用不同。脈絡(luò)叢中各種細(xì)胞因為炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)錄復(fù)制各種蛋白，同樣在SS2感染的致病機(jī)理產(chǎn)生作用。多數(shù)學(xué)者從呼吸道感染途徑對豬鏈球菌的致病機(jī)理進(jìn)行大量研究，然而SS2是如何經(jīng)消化道感染豬和人尚不明確，且對其傳播機(jī)理的研究甚少。Enckevort等研究表明SS2可穿過腸壁到腸系膜淋巴結(jié)，并感染內(nèi)臟器官，豬鏈球菌存在于環(huán)境的各種組成部分以及人體的各種器官中，當(dāng)外界和腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時，就會改變腸上皮細(xì)胞的通透性，豬鏈球菌有可能侵入腸黏膜上皮穿過細(xì)胞層而感染機(jī)體。這顯示腸道是SS2侵入的途徑。因此，研究豬鏈球菌病消化道的傳播途徑十分重要，試驗以消化道感染途徑為切入點，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)等方法，建立體外細(xì)胞感染模型，從細(xì)胞和分子水平上研究SS2經(jīng)消化道黏膜感染的致病機(jī)理，揭示消化道感染可能是豬鏈球菌病一個潛在的重要傳播途徑，從而為深入研究SS2致病機(jī)理及機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)，為研發(fā)2型豬鏈球菌病疫苗和藥物作用靶點提供新的有效途徑。

1 材料

Caco-2細(xì)胞，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；2型豬鏈球菌1330（弱毒）株和458（強(qiáng)毒）株。

2 方 法

2.1 主要溶液的配制 （1）PBS（-）液：NaC120.0 g+KC110.5 g+Na2HPO4·12H2O 2.8 g+KH2PO40.5 g，先后溶于少量三蒸水中，然后定容至2 000 mL，磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枞芙?，分裝于250 mL瓶中，每瓶200 mL，高壓30 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞培養(yǎng)前添加青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL（雙抗）（或根據(jù)需要添加3～4倍量雙抗），分裝，標(biāo)記，4℃儲存?zhèn)溆?。?）4%臺盼藍(lán)母液配制：稱4 g臺盼藍(lán)加少許蒸餾水研磨，加雙蒸水定容到100 mL，濾紙過濾，4℃保存。使用時用PBS（-）稀釋 10倍至 0.4%，取9滴細(xì)胞懸液與1滴臺盼藍(lán)染液混合，3 min內(nèi)測定細(xì)胞活力。（3）THB培養(yǎng)基配制：胰蛋白胨20 g+酵母浸出物3 g+葡萄糖2 g+NaC12 g+Na2CO32 g+牛肉膏5 g+NaHCO30.4 g，先后溶于少量三蒸水，定容至1 000 mL，磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枞芙?，分裝250 mL瓶中，每瓶200 mL，115℃高壓20 min，將pH調(diào)至7.5～7.8。（4）感染培養(yǎng)基配制：100 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、0.1%的50 mmo1/Lβ-巰基乙醇、0.2 gNaHCO3，將 pH 調(diào)至 7.2～7.4。

2.2 復(fù)蘇細(xì)胞 （1）從液氮罐中小心取出凍存管，迅速浸沒在37℃溫水中快速均勻晃動，使凍存細(xì)胞溶液快速完全融解。（2）1 000 r/min離心10 min，棄上清，用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力后，調(diào)整細(xì)胞密度接種于24孔板。細(xì)胞成活率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。（3）將剩余的細(xì)胞懸液吸入裝有完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)液，約3～4 d傳代一次。

2.3 細(xì)菌培養(yǎng) （1）用THB平板復(fù)蘇菌株，37℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基。（2）培養(yǎng)18 h，再以1%量接種于THB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，并同時分別涂布 THB平板，以測定SS2菌株的生長曲線。（3）測完4種SS2菌株的生長曲線后，取對數(shù)生長期的菌株，6 000 r/min離心15 min，棄上清，PBS重懸后6 000 r/min離心15 min，棄上清，再次PBS重懸后6 000 r/min離心15 min。（4）棄上清，加入感染培養(yǎng)液，并用感染培養(yǎng)液稀釋成細(xì)菌：細(xì)胞=1：100的菌懸液。

2.4 黏附試驗 （1）取對數(shù)生長期SS2菌液（5×108個/mL），8 000 g離心10 min，用PBS重懸后6 000 g離心，再重復(fù)一次。最后離心去上清，用感染培養(yǎng)液重懸。（2）取出細(xì)胞板，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗3次以除去抗生素。（3）按照細(xì)菌細(xì)胞比100：1加入至細(xì)胞板中，用感染培養(yǎng)液定容至500 uL。（4）2 000 g離心5 min，以加強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞接觸。（5）37℃孵育30 min，2 h和4 h之后棄培養(yǎng)液，用PBS洗6次，每次500 uL，最后4次涂板。（6）每孔加入200 uL胰酶，消化5 min，加入 300 uL PBS，吹打后稀釋102、104、105、106，涂板。（7）2 h 時，在細(xì)胞板剩余孔中加入兩個空白對照，即只加入細(xì)菌，不加細(xì)胞，與其他孔作相同處理，用PBS涂板。

2.5 侵襲試驗 （1）取對數(shù)生長期細(xì)菌（5×108個/mL），6 000 g離心10 min，棄上清；PBS重懸后6 000 g離心，棄上清；再加入PBS重懸，6 000 g離心，后用感染培養(yǎng)液重懸。（2）取細(xì)胞板，吸取DMEM完全培養(yǎng)液，用1 mL PBS清洗3次，以除去抗生素。（3）按細(xì)菌細(xì)胞比100：1加入細(xì)菌，最后定容至1 mL。（4）2 000 g離心5 min，以加強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞接觸。（5）37℃孵育2 h和4 h，棄感染培養(yǎng)液，用1 mL PBS洗6次，最后4次涂板。（6）每孔加入 500 uL1%TritonX-100，裂解物用 PBS 稀釋 102、104、106、108涂板、培養(yǎng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 SS2（1330）細(xì)菌的生長曲線 用THB平板復(fù)蘇菌株，37℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落接種于THB，培養(yǎng)18 h，再以1%量接種于THB，培養(yǎng)至OD600為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，并同時分別涂布 THB 平板以測定SS2菌株的生長曲線，見圖1。

由SS2生長曲線可知，SS2細(xì)菌的對數(shù)生長期在10～12 h，本試驗采用過夜培養(yǎng)，所得到的細(xì)菌處于對數(shù)生長期，通過平板計數(shù)SS2為5×108個/mL。

圖 1 SS2（1330）生長曲線

3.2 黏附與侵襲試驗計數(shù)結(jié)果 SS2細(xì)菌細(xì)胞壁上有磷脂酸等，與動物皮膚及黏膜表面的細(xì)胞具有高度親和力，其莢膜成分、M蛋白等具有抗吞噬作用，后者都是菌毛狀，具有黏附作用。黏附和侵襲試驗結(jié)果見表1-表2。

表1 細(xì)菌黏附試驗結(jié)果

表2 細(xì)菌侵襲試驗結(jié)果

洗液為PBS，第6次洗液計數(shù)都小于102，說明最后黏附和侵襲試驗所計數(shù)都是與細(xì)胞發(fā)生黏附和侵襲到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)，而排除了未發(fā)生黏附和侵襲作用細(xì)菌所造成的偏差。對照試驗是在沒有接種細(xì)胞的孔板上，對細(xì)菌進(jìn)行相同處理，以排除組間差異。

通過平板計數(shù)結(jié)果可以看出：458#（強(qiáng)毒株）和1330#（弱毒株）都可以與Caco-2細(xì)胞發(fā)生黏附，并分析出458#比1330#更加容易黏附在細(xì)胞表面，事實上，458#比1330#更具有致病性。換句話說，容易發(fā)生黏附的細(xì)菌具有更強(qiáng)的致病性，由此推測，大部分致病性SS2能高水平黏附于消化道黏膜細(xì)胞上。

4 結(jié)論

1）豬鏈球菌同一血清型不同菌株之間以及不同血清型菌株之間的毒力有較大差異，并非所有的血清型均有致病性，且同一血清型的菌株不一定都引起相同的疾病，本試驗結(jié)果也證實了這一點。

2）2型豬鏈球菌的1330株和458株對Caco-2細(xì)胞均具有黏附作用，458株的黏附和侵襲作用更強(qiáng)，表明細(xì)菌的黏附作用與其毒力有一定的關(guān)聯(lián)。