藍(lán)莓葉不同溶劑提取物抗氧化活性研究

劉 曦，祝連彩，王伯初

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400044）

人體在新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）[1]，包括超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）、脂氧自由基等自由基和過氧化氫（H2O2）等非自由基基團(tuán)，它們具有強(qiáng)氧化性，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的組織和細(xì)胞[2]，是很多疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、大腦功能障礙和風(fēng)濕病等產(chǎn)生的重要原因[3]。大量文獻(xiàn)報(bào)道，很多中草藥、水果、蔬菜具有抗氧化活性，并且從這些食用及藥用植物中尋找低毒、安全、有效的天然抗氧化劑已成為抗氧化劑發(fā)展的必然趨勢(shì)[4-6]。藍(lán)莓，又稱越橘、藍(lán)漿果，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓果實(shí)中有大量的黃酮、多酚、花青素等活性物質(zhì)，且有較高的抗氧化活性[7]，但其昂貴的價(jià)格極大的限制了藍(lán)莓的廣泛應(yīng)用，進(jìn)而人們把注意力轉(zhuǎn)移到藍(lán)莓葉上。有報(bào)道藍(lán)莓葉中含有總酚、原花青素等[8]。此外，藍(lán)莓葉提取物有降血糖[9]、降血脂[10]、預(yù)防癌癥[11]等藥理作用，因此有必要對(duì)藍(lán)莓葉進(jìn)行研究以考察其在食品、藥品等方面的應(yīng)用潛力。對(duì)藍(lán)莓葉抗氧化活性雖有報(bào)道，但都是用80%乙醇[10]、70%丙酮[12]等提取，缺乏系統(tǒng)性的研究，因此本論文用不同極性溶劑提取藍(lán)莓葉，對(duì)其提取物中的總酚和黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，并運(yùn)用DPPH自由基、ABTS自由基、β-胡蘿卜素-亞油酸體系等方法考察藍(lán)莓葉不同極性溶劑提取物體外抗氧化能力，旨在為系統(tǒng)開發(fā)藍(lán)莓植物資源在食品、醫(yī)藥和保健領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藍(lán)莓葉樣品 于2011年9月采自貴州省麻江縣藍(lán)莓種植基地，經(jīng)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院李正國教授鑒定為兔眼藍(lán)莓（Vaccinium blueberry）葉；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亞油酸、β-胡蘿卜素、Folin-Ciocalteu 美國Sigma公司；沒食子酸、蘆丁、三氯化鋁、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、2，2-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）等 均為國產(chǎn)分析純。

Lambda 900 型紫外分光光度計(jì) 美國Perlin Elmer公司；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BUCHI R205-V800型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；冷凍干燥機(jī) 北京醫(yī)博康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA2004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓葉不同溶劑提取工藝 將新鮮藍(lán)莓葉置于55℃干燥箱中干燥，粉碎過20目篩得藍(lán)莓葉粉末，分別精密稱取適量的藍(lán)莓葉粉末6份，按1∶40（g/mL）比例加入不同提取溶劑（蒸餾水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚），在水浴鍋上回流提取3次，各2h（煮沸后）。抽濾后得不同溶劑提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至近干時(shí)，用少量溶劑轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，經(jīng)冷凍干燥得藍(lán)莓葉不同溶劑提取物。精密稱取各提取物，分別用50%甲醇溶解為質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的母液，置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總酚含量測(cè)定[13]總酚含量用Folin-Ciocalteu試劑測(cè)定。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取10.0mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇溶解成濃度為2.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL移入EP管中，加50%甲醇至1.0mL。取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1mL，加入1.0mL 50% Folin-Ciocalteu試劑，混合1min后加入2.0mL 0.2g/L碳酸鈉溶液，再用蒸餾水定容至5.0mL，充分振蕩混勻后于25℃黑暗條件下溫育2h，在760nm的波長處測(cè)定吸光值（A）。以沒食子酸的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y），吸光值為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=11.24X-1.013，R2=0.997，線性范圍為2.0～10.0μg/mL。

總酚含量的測(cè)定：分別精密量取待測(cè)液0.1mL，按線性關(guān)系考察方法在760nm處測(cè)定吸光值，并根據(jù)沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品的總酚含量。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定[14]總黃酮含量用三氯化鋁顯色法測(cè)定。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取17.5mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇溶解成濃度為2.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，移入EP管中，各加50%甲醇至1.0mL。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5mL，向其中加入0.1g/L AlCl3100μL，1mol/L醋酸酐100μL，加蒸餾水使其反應(yīng)體系為3.0mL，充分振蕩后于室溫條件下放置30min，在415nm的波長處測(cè)定吸光值（A）。以蘆丁的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y），吸光值為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=31.32X+0.087，R2=0.999，線性范圍為4.17～27.78μg/mL。

總黃酮含量測(cè)定：分別精密量取待測(cè)液0.5mL，按線性關(guān)系考察方法在415nm處測(cè)定吸光值，并根據(jù)蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品的總黃酮含量。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 清除DPPH自由基測(cè)定[15]0.1mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和1.9mL 0.09mmol/L DPPH乙醇溶液混合，劇烈振蕩后置黑暗條件下反應(yīng)30min，在517nm波長處測(cè)定吸光度。以不加樣品為空白對(duì)照，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）為陽性對(duì)照，對(duì)DPPH自由基的清除率按式（1）計(jì)算。

式中：Ao為空白樣品吸光度；As為待測(cè)樣品吸光度。

EC50值定義為清除50%自由基所需的樣品質(zhì)量濃度，其計(jì)算是通過獲得的抑制DPPH自由基回歸方程所得。以待測(cè)樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），抑制率為縱坐標(biāo)（Y）得待測(cè)樣品清除DPPH自由基的關(guān)系曲線。計(jì)算得到待測(cè)樣品的半數(shù)抑制濃度（EC50）。

1.2.4.2 清除ABTS自由基測(cè)定[16]在濃度為7mmol/L ABTS溶液中加入過硫酸鉀使其終濃度為2.45mmol/L，充分混合均勻，將混合反應(yīng)液在室溫避光的條件下放置12～16h（ABTS反應(yīng)液須新鮮配制，保留的最長時(shí)間為3d）。在EP管中加入200μL樣品溶液、300μL ABTS反應(yīng)液，然后加入0.5mL 50%甲醇溶液，充分振蕩均勻，反應(yīng)2min后，在745nm處測(cè)定吸光度。以不加樣品為空白對(duì)照，用BHT作為陽性對(duì)照，對(duì)ABTS自由基的清除率按式（1）計(jì)算。

以待測(cè)樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），抑制率為縱坐標(biāo)（Y）得待測(cè)樣品清除ABTS自由基的關(guān)系曲線。計(jì)算得到待測(cè)樣品的半數(shù)抑制濃度（EC50）。

1.2.4.3 β-胡蘿卜素/亞油酸體系中抗脂質(zhì)過氧化作用的測(cè)定[17]在250mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加入1.0mL 0.2mg/mL的β-胡蘿卜素氯仿溶液，再依次加入25μL亞油酸和200mg土溫-40，混合均勻后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)氯仿，然后加入100mL氧飽和蒸餾水，劇烈振蕩即得反應(yīng)液。取上述反應(yīng)液2400μL加入反應(yīng)管中，加入不同濃度梯度的待測(cè)樣品溶液100μL。在470nm處測(cè)定起始吸光度，50℃溫育2h后再測(cè)定吸光度。以不加樣品溶液的β-胡蘿卜素/亞油酸體系作為空白對(duì)照。用BHT作為陽性對(duì)照，對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率按式（2）計(jì)算。

式中：Aco、Act分別為空白樣品起始和溫育2h后的吸光度；Aso、Ast分別為待測(cè)樣品起始和溫育2h后的吸光度。

IC50值定義為反應(yīng)被抑制一半時(shí)所需的樣品濃度，其計(jì)算是通過獲得的抗脂質(zhì)過氧化能力的回歸方程所得。以待測(cè)樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），脂質(zhì)過氧化抑制率為縱坐標(biāo)（Y）得待測(cè)樣品抗脂質(zhì)過氧化能力的關(guān)系曲線。計(jì)算得到待測(cè)樣品的半數(shù)效應(yīng)濃度（IC50）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差分析運(yùn)用Duncan極差法，數(shù)據(jù)以x±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓葉提取物中有效成分含量

6種不同藍(lán)莓葉提取物中總酚和黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，藍(lán)莓葉提取物中總酚和黃酮含量隨提取溶劑的不同而有所變化。水提取物的總酚含量最高，為（264.67±0.29）mg/g，隨著提取溶劑極性的減小，含量逐漸減低，石油醚提取物的總酚含量最低，僅（10.12±0.20）mg/g；甲醇提取物中的黃酮含量最多，為（68.94±0.08）mg/g，然后依次是乙醇、水、乙酸乙酯提取物，分別是（59.99±0.05）mg/g、（53.34±0.02）mg/g、（37.02±0.06）mg/g，而氯仿、石油醚提取物中黃酮含量較少，僅3mg/g左右。

表1 不同溶劑的藍(lán)莓葉提取物有效成分測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 1 Total phenols and flavonoids contents of different extracts from Vaccinium blueberry leaves（n=3）

2.2 不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力

DPPH自由基清除法已被廣泛應(yīng)用于從水果、蔬菜和天然中藥材提取物等中，篩選抗氧化活性物質(zhì)[18]。由圖1可知，不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出強(qiáng)弱不一的清除能力，且在一定濃度范圍內(nèi)（0.5～100.0μg/mL）呈明顯的量效關(guān)系，其中水提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，其次是甲醇，均強(qiáng)于對(duì)照品2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）；樣品濃度在0.5～10.0μg/mL時(shí)，乙醇提取物的DPPH自由基清除能力比BHT強(qiáng)，隨著濃度的增大，BHT的清除能力大于乙醇提取物；如表2和圖1所示，相對(duì)于對(duì)照品BHT的EC50（23.96±0.03）μg/mL，水提物和甲醇提取物較小，分別為（12.78±0.10）、（18.74±0.02）μg/mL，各物質(zhì)清除DPPH自由基能力為：水提取物＞甲醇提取物＞BHT＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差異不顯著（p＞0.05），即氯仿提取物和石油醚提取物清除DPPH自由基能力相當(dāng)，且活性很小。

2.3 不同溶劑提取物清除ABTS自由基能力

ABTS自由基清除法目前已被廣泛應(yīng)用于親水性和親脂性物質(zhì)總抗氧化能力的測(cè)定[19]。由圖2可知，不同極性溶劑提取物對(duì)ABTS自由基表現(xiàn)出強(qiáng)弱不一的清除能力，且在一定的濃度范圍（0.4～12.9μg/mL）呈明顯的量效關(guān)系。低濃度時(shí)，水提物對(duì)ABTS+·的清除率較陽性對(duì)照BHT強(qiáng)，但隨著濃度的增大，BHT的清除活性增強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度為12.9μg/mL時(shí)，各物質(zhì)的ABTS自由基清除率分別為74.26%、63.88%、56.72%、16.96%、5.61%和4.66%。如圖2各物質(zhì)的半數(shù)清除濃度所示，物質(zhì)清除ABTS自由基的能力為：水提取物＞BHT＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，但BHT和甲醇、乙醇提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差異不顯著（p＞0.05），表示甲醇提取物與乙醇提取物清除ABTS自由基能力與BHT相當(dāng)，氯仿提取物和石油醚提取物清除ABTS自由基能力相當(dāng)。

圖2 不同提取物清除ABTS自由基能力Fig.2 ABTS radical scavenging activity of different extracts from Vaccinium blueberry leave

表2 藍(lán)莓葉不同極性溶劑提取物清除自由基EC50和抗脂質(zhì)過氧化IC50Table 2 EC50 of scavenging capacities for free radicals and IC50 of anti-lipid peroxidation of different extracts from Vaccinium blueberry leaves

2.4 不同提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力

由圖3可知，不同極性提取物表現(xiàn)出強(qiáng)弱不一的抗脂質(zhì)過氧化能力，在一定的濃度范圍（0.2～80.0μg/mL）呈現(xiàn)量效關(guān)系，但其抗脂質(zhì)過氧化能力均小于陽性對(duì)照BHT，具有顯著性差異（p＜0.05）；如表2所示，水提物、甲醇提取物對(duì)β-胡蘿卜素淬滅的抑制能力的IC50分別為（25.33±0.02）μg/mL、（60.87±0.09）μg/mL，而乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取物的IC50均大于80μg/mL，結(jié)合圖3，各提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力為：水提取物＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差異不顯著（p＞0.05），表示氯仿提取物和石油醚提取物抗脂質(zhì)過氧化能力相當(dāng)，且能力均較弱。

圖3 不同提取物抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.3 The activity of anti-lipid peroxidation of different extracts from Vaccinium blueberry leave

2.5 總酚和黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性

如表3所示，濃度為20μg/mL的不同溶劑藍(lán)莓葉提取物中總酚含量與抗氧化能力之間有較好的相關(guān)性，其中ABTS自由基清除能力、抗脂質(zhì)過氧化能力與總酚的R2在0.97以上，對(duì)DPPH自由基的清除能力的相關(guān)系數(shù)也達(dá)到0.93，相關(guān)性極顯著（p＜0.01），可以認(rèn)為藍(lán)莓葉提取物中總酚含量的多少直接反映提取物抗氧化能力的強(qiáng)弱。黃酮含量與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及抗脂質(zhì)過氧化能力的相關(guān)系數(shù)分別為0.840、0.823、0.638，有顯著的相關(guān)性（p＜0.05），因此黃酮含量的多少與提取物抗氧化能力具有相關(guān)關(guān)系。

表3 藍(lán)莓葉不同溶劑提取物總酚和黃酮與抗氧化活性的相關(guān)性（C=20μg/mL）Table 3 The correlation between content of the total phenols and flavonoids and the activity of different extracts from Vaccinium blueberry leaves（C=20μg/mL）

3 結(jié)果與討論

為獲得可信的結(jié)論，本研究采用DPPH自由基清除體系、ABTS自由基清除體系和β-胡蘿卜-亞油酸體系對(duì)藍(lán)莓葉不同極性溶劑提取物的抗氧化能力進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。研究表明，藍(lán)莓葉不同溶劑提取物的抗氧化活性存在較大差異，但三種評(píng)價(jià)體系所得出的其抗氧化能力的順序一致，即水提取物＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物。水提物具有極強(qiáng)的清除自由基的活性，活性顯著大于化學(xué)抗氧化劑BHT，差異顯著（p＜0.01）；具有中等強(qiáng)度的抗脂質(zhì)過氧化的能力，半數(shù)抑制濃度為（25.33±0.02）μg/mL。很多研究均表明天然提取物的抗氧化的能力強(qiáng)于化學(xué)合成的抗氧化劑，如Mehmet[20]發(fā)現(xiàn)薄荷提取物的清除DPPH自由基的活性優(yōu)于陽性對(duì)照BHT，Masoumeh等[21]在研究艾菊提取物的抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)其DPPH自由基清除活性比陽性對(duì)照BHT好。在已報(bào)道的對(duì)藍(lán)莓葉抗氧化的研究中，主要使用的提取溶劑為有機(jī)類溶劑，如Marian[12]等用70%丙酮、Zhao等[22]用60%乙醇提取藍(lán)莓葉測(cè)定提取物的抗氧化活性，但本研究證明以水作為提取溶劑能夠獲得抗氧化活性最好的提取物。

已有大量的研究表明，酚類化合物是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，而黃酮類化合物是植物為抵抗外部環(huán)境，如紫外線等產(chǎn)生的一類含量最為豐富酚類化合物。因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了各提取物的總酚和總黃酮的含量，并應(yīng)用SPSS 17.0對(duì)總酚和總黃酮的含量與抗氧化活性的相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，總酚含量與提取物抗氧化活性具有極顯著相關(guān)性（p＜0.01），與總黃酮含量具有顯著相關(guān)性（p＜0.05），這提示藍(lán)莓葉中除黃酮類化合物外，還存在其他具有抗氧化活性的酚類化合物，另外結(jié)合水提物的總酚含量最高、活性最強(qiáng)可以推斷藍(lán)莓葉中存在的其他抗氧化成分的極性相對(duì)比較大。因此可以選擇總酚含量作為藍(lán)莓葉抗氧化提取物質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

如今人們?cè)絹碓街匾曌陨淼慕】岛褪称返臓I養(yǎng)要求，從植物中提取天然抗氧化劑是食品和醫(yī)療保健行業(yè)發(fā)展的一種趨勢(shì)。本研究表明相對(duì)于有機(jī)溶劑，水提物的抗氧化活性好、活性成分含量高，避免了有機(jī)溶劑殘留問題，為藍(lán)莓葉保健品的研究與開發(fā)進(jìn)行了有益的探索，促進(jìn)藍(lán)莓資源的綜合開發(fā)和利用。

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