烏骨雞黑色素氧化降解產(chǎn)物成分初探

田穎剛，趙溪雁，喬娟娟，朱 勝，張 麗

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

烏骨雞（Gallus gallus domesticus Brisson）作為藥食兩用的滋補(bǔ)品在我國應(yīng)用歷史悠久，烏骨雞的特殊性就在于其體內(nèi)富含黑色素[1]。烏骨雞黑色素具有抗誘變、延緩衰老、抑制流感病毒、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等多種生理功能[2-6]。目前烏骨雞黑色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚不清楚，我們圍繞其結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)已開展了一些有益的探究工作。電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）分析發(fā)現(xiàn)，烏骨雞黑色素中含有Fe、Ca、Mg和Zn等多種金屬元素，表明黑色素對金屬離子有富集作用[7]。烏骨雞黑色素理化性質(zhì)研究表明：烏骨雞黑色素性質(zhì)比較穩(wěn)定，幾乎不溶于所有溶劑，對金屬離子有親和力，具有電子自旋性。烏骨雞黑色素光譜學(xué)研究表明在紫外和可見區(qū)無明顯的吸收峰，但在200～400nm之間呈現(xiàn)吸光值迅速增加，紅外光譜表明黑色素結(jié)構(gòu)中含有脂肪族結(jié)構(gòu)[8-10]，但目前尚無其他化學(xué)結(jié)構(gòu)研究佐證。本項(xiàng)目組采用NaOH-H2O2氧化降解法烏骨雞黑色素，以傅里葉紅外光譜、GC/MS對降解產(chǎn)物乙醚萃取物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物中存在C16～C32系列烷烴，從而為論證烏骨雞黑色素中存在脂肪族結(jié)構(gòu)提供了有力的佐證，為烏骨雞黑色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏骨雞 70～80日齡，購自江西泰和縣；木瓜蛋白酶（40萬U/g）、濃鹽酸、無水乙醇、KBr、Na2SO3、30%H2O2、乙醚、氫氧化鈉 試劑均為分析純，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TDL5M型臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司；TGL-16G-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Precisa XB220A型分析天平 瑞士；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-2C型pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；HITACHI H-600型透射電子顯微鏡 日本日立；SPI型傅立葉紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer；6890型氣相色譜、5973型質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烏骨雞黑色素的精制 取泰和烏骨雞，宰殺、去毛、頭、爪、內(nèi)臟，洗凈。用絞肉機(jī)絞成肉泥，取肉泥50g，加入倍量水，0.1%木瓜蛋白酶，（63±1）℃酶解8h，升溫煮沸0.5h，滅酶，趁熱濾布過濾，濾液高速離心（10000r/min，10min），沉淀即為烏骨雞黑色素粗品。取黑色素粗品10g，加入2mol/L的HCl 100mL，90℃回流3h后過濾，棄濾液，連續(xù)回流5次后用蒸餾水洗滌至中性，再用乙醇、CM試劑多次洗滌，干燥后即為精制烏骨雞黑色素。

1.2.2 烏骨雞黑色素的形態(tài)觀察 取精制烏骨雞黑色素，過160目篩，取少量與乙醇混合，超聲使樣品分散成均勻混合液，用玻璃毛細(xì)管吸取混合液滴2～3滴在微柵網(wǎng)上，置透射電鏡下進(jìn)行觀察并記錄，工作電壓75kV。

1.2.3 烏骨雞黑色素降解 精密稱取烏骨雞黑色素6份，每份100mg，置于50mL反應(yīng)釜內(nèi)，加入pH12的NaOH溶液20mL，以0.2mL/min的流速加入30%的H2O23.4mL，90℃保溫?cái)嚢璺磻?yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為2、4、8、12、16、20h，反應(yīng)結(jié)束后流水冷卻，加入12mL 10%Na2SO3溶液終止反應(yīng)。降解液定重至40g，取混勻的降解液10g離心，蒸干上清，干燥上清干物質(zhì)，沉淀至恒重，按下式計(jì)算可溶性產(chǎn)物得率，同法制取不含烏骨雞黑色素樣品的降解空白對照。

取降解液25g，乙醚萃取5次，每次5mL，合并乙醚，無水硫酸鈉脫水，0.22μm微孔濾膜過濾，得樣品，供GC/MS分析。取烏骨雞黑色素制成懸液，同法乙醚直接萃取，得黑色素不降解空白對照樣品，供GC/MS分析。

1.2.4 傅立葉紅外光譜 分別稱取烏骨雞黑色素以及黑色素的降解物乙醚萃取物各1mg在瑪瑙缽中混勻，研成細(xì)粉，溴化鉀壓片。在400～4000cm-1范圍內(nèi)測其紅外吸收光譜。

1.2.5 GC/MS條件

1.2.5.1 色譜條件 Agilent HP-5 毛細(xì)管色譜柱（30m×250μm，0.25μm）；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL，不分流，進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫：初始溫度60℃，保留3min，以5℃/min的速率升至300℃，保留15min；檢測器溫度250℃；載氣He，流速1mL/min。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 EI電離源；電子能量70eV；離子源溫度230℃；接口溫度250℃；掃描周期2.84次/s，掃描范圍33～500u；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)MSD chem Station；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫：NIST02。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏骨雞黑色素電鏡分析

圖1 烏骨雞黑色素透射電鏡圖Fig.1 The transmission electron microscope image of BSFM

由圖1可知，蛋白酶/鹽酸法提取分離所得的烏骨雞黑色素呈比較規(guī)則的橢球顆粒，赤道軸長和極軸長分別為33～34nm、66～67nm，邊緣清晰光滑，周圍無明顯的附著物，說明該法所獲得的烏骨雞黑色素比較純凈，可為后期烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)研究提供性質(zhì)穩(wěn)定、純凈的原料來源。

2.2 烏骨雞黑色素可溶性降解產(chǎn)物得率

圖2 不同降解時(shí)間可溶性產(chǎn)物得率Fig.2 Yields of water-soluble products at different degradation times

由圖2可知，隨著降解時(shí)間的延長，可溶性產(chǎn)物得率逐漸增加，到12h時(shí)達(dá)到最大為56%，之后可溶性產(chǎn)物得率減少并基本趨于穩(wěn)定，12h之后可溶性產(chǎn)物得率降低是由于易揮發(fā)性物質(zhì)隨降解時(shí)間增長而產(chǎn)生，并隨水蒸氣逸散所致。

2.3 傅立葉紅外光譜分析

[11-12]方法對烏骨雞黑色素以及黑色素的降解物乙醚萃取物紅外圖譜（見圖3）進(jìn)行分析。烏骨雞黑色素在2961.0、2929.3、2863.6cm-1處的吸收為3000 ～2800cm-1區(qū) 脂 肪 族C-H 的 伸 縮 振 動(dòng)，在1450cm-1附近的吸收為脂肪族C-H的彎曲振動(dòng)，烷烴結(jié)構(gòu)吸收峰強(qiáng)度較弱。

烏骨雞黑色素降解物的乙醚萃取物在2954.0、2924.3、2854.2cm-1處有很強(qiáng)的吸收，為2960～2850cm-1區(qū)烷基C-H的伸縮振動(dòng)吸收帶，1461.0、1378.4cm-1為1470～1370cm-1區(qū)烷基的變形振動(dòng)吸收帶，且在722.7cm-1處的吸收帶為725cm-1附近的CH2基的平面內(nèi)搖擺振動(dòng)吸收帶，上述結(jié)果表明降解物乙醚萃取部分中含有-CH2-結(jié)構(gòu)。

2.4 GC/MS分析

圖3 烏骨雞黑色素（a）及降解產(chǎn)物乙醚萃取物（b）紅外圖譜Fig.3 Infared spectrum image of melanin from Black-bone Silky Fowl（a）and ethereal extract from degradation products of BSFM（b）

采用GC/MS對無黑色素降解空白乙醚萃取物、未降解烏骨雞黑色素乙醚萃取物及烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物乙醚萃取物進(jìn)行分析（見圖4～圖7，表1），結(jié)合參考文獻(xiàn)[13-14]及與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST02.L匹配，結(jié)果表明無黑色素降解空白與未降解烏骨雞黑色素直接萃取物中均未發(fā)現(xiàn)烷烴類結(jié)構(gòu)成分，而烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物乙醚萃取部分中存在C16～C32一系列不同碳連長度的正構(gòu)烷烴及非正構(gòu)烷烴，這表明降解產(chǎn)物中的烷烴組分是烏骨雞黑色素經(jīng)過NaOHH2O2降解產(chǎn)生的。降解產(chǎn)物中烷烴以長鏈烷烴居多，碳數(shù)在25以上（含25）占所有烷烴含量的75.44%。推測烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)中可能存有長鏈脂肪族結(jié)構(gòu)。

圖4 無黑色素降解空白的乙醚萃取物總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of ethereal extract from degradation blank

圖5 烏骨雞黑色素未降解的乙醚萃取物總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of ethereal extract from BSFM

圖6 烏骨雞黑色素12h降解產(chǎn)物（a）和16h降解產(chǎn)物（b）乙醚萃取物總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of ethereal extract from 12h degradation products（a）and 16h degradation products（b）of BSFM

圖7 烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物（20h）乙醚萃取物總離子流色譜圖Fig.7 Total ion chromatogram of ethereal extract from degradation products（20h）of BSFM

3 結(jié)論與討論

采用蛋白酶/鹽酸法分離純化烏骨雞黑色素，可將附著在烏骨雞黑色素周圍的蛋白質(zhì)去除干凈，投射電鏡下可觀察到游離的規(guī)則橢球顆粒的烏骨雞黑色素，表明蛋白酶/鹽酸法所獲得的烏骨雞黑色素周圍無明顯附著物，減少了多余蛋白質(zhì)對烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)分析的影響，可為后期烏骨雞黑色素的結(jié)構(gòu)研究提供較為純凈、性質(zhì)穩(wěn)定的原材料。

Luigi Zecca等[15]通過傅里葉紅外光譜、高溫裂解-氣質(zhì)聯(lián)用發(fā)現(xiàn)人腦黑色素中存在長鏈烷基類化合物。本文采用傅里葉紅外光譜及GC/MS對烏骨雞黑色素降解產(chǎn)物進(jìn)行分析同樣發(fā)現(xiàn)其中存在C16～C32一系列烷烴。根據(jù)GC/MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，烏骨雞黑色素12h降解的樣品中未明顯出現(xiàn)烷烴組分，而16h降解的樣品中烷烴開始出現(xiàn)，20h降解的樣品中則出現(xiàn)大量不同鏈長的烷烴，進(jìn)而推測隨著降解時(shí)間的延長，烷烴種類和含量均增加，提示烏骨雞黑色素結(jié)構(gòu)中可能存有長鏈脂肪族結(jié)構(gòu)，其來源可能為：烏骨雞黑色素主體結(jié)構(gòu)通過不同長度的脂肪族碳鏈連接在一起，在降解過程中碳鏈與主體結(jié)構(gòu)間的連接被打斷產(chǎn)生烷烴；烏骨雞黑色素中存在的環(huán)狀碳鏈結(jié)構(gòu)，在降解過程中被打斷，產(chǎn)生烷烴。本文結(jié)果為論證烏骨雞黑色素化學(xué)結(jié)構(gòu)中存有長鏈脂肪族碳鏈結(jié)構(gòu)提供了佐證。

表1 烏骨雞黑色素降解物（20h）乙醚萃取物中烷烴組分分析Table 1 Analysis of alkanes in ethereal extract from degradation products（20h）of BSFM

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