黑木耳多糖的提取分離及體外抗凝血作用研究

王辰龍，張子奇，王 曼，丁之恩，* ，閆曉明

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036;2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽合肥230031)

黑木耳又稱云耳、黑菜，是一種質(zhì)優(yōu)的膠質(zhì)食用菌和藥用菌。我國黑木耳資源豐富，年產(chǎn)量5000t 左右，占世界總產(chǎn)量的90%以上，為開發(fā)應(yīng)用黑木耳提供了有利條件。黑木耳多糖具有預(yù)防冠心病、高血壓、高血脂、抗血栓、抗衰老、抗癌防癌、調(diào)節(jié)免疫等作用［1-3］。目前應(yīng)用于臨床治療的抗凝血藥物主要是肝素和香豆素類藥物，有誘發(fā)血小板癥等副作用。開發(fā)對血栓性疾病具有預(yù)防作用的新型藥物或功能性食品具有重要的意義。因而，探索黑木耳多糖對人體血液系統(tǒng)的影響具有重要的意義［4］。目前報道具有抗凝血作用的多糖類物質(zhì)有茶葉多糖［5］、桑葉多糖［6］、玉米芯水溶性多糖［7］等，并對不同來源的多糖進行純化、分子量大小組分分離、多糖修飾等，均在一定條件下表現(xiàn)出了抗凝血活性。本實驗以大別山野生黑木耳為原料，通過正交實驗優(yōu)化黑木耳多糖提取工藝，經(jīng)純化后研究其抗凝血作用的最適條件。已有文獻報道的多糖類物質(zhì)的抗凝血作用都是在實驗室條件下的研究，本實驗近似模擬生物體溫度、血漿pH 條件，對黑木耳多糖的真實抗凝血效應(yīng)進行研究，為充分利用黑木耳資源以及在生物、醫(yī)藥、食品方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 安徽省金寨縣大別山生態(tài)農(nóng)產(chǎn)品公司;纖維素酶(100000U/g)、果膠酶(20000U/g) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;95%乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、氫氧化鈉、氯仿、正丁醇、濃氨水、雙氧水、檸檬酸鈉等 均為分析純。

T6-新世紀紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;SB5200D 超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;MPG-3型CAL200 凝聚儀 上海斯隆醫(yī)電設(shè)備有限公司;DL-5-B 高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;DHG-9423A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳多糖提取工藝流程 原料→干燥(60℃、24h)→粉碎→過篩(60 目)→提取→過濾→上清液→醇沉多糖→除蛋白、脫色→靜置→離心→上清液→冷凍干燥→多糖粗品

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制［8］準確稱取干燥的葡萄糖0.01g，溶解后定容到100mL 容量瓶中，即為葡萄糖標準溶液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL 的葡萄糖標準溶液于試管中，補水至2mL。分別加入質(zhì)量分數(shù)6%的苯酚溶液1mL，再加入濃硫酸5mL，搖勻，室溫下避光靜置20min 后于490nm 下測定吸光度，相同條件下以2mL 水做空白，以多糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 黑木耳多糖的提取方法 黑木耳多糖的提取分別采用熱水提取法［9］、堿液提取法［10］、超聲波提取法［11］、超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取法［12-17］。其中，超聲波協(xié)同酶法的操作方法:黑木耳干粉按1∶50(w/v)加水，加入適當磷酸二氫鉀-磷酸氫二納緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 到5.0，待溫度升至45℃，以500U/g 加入果膠酶，在150W 超聲波功率下酶解60min 后迅速升溫至90℃鈍化酶活10min;再加入適當磷酸二氫鉀-磷酸氫二納緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 到7.5，調(diào)節(jié)溫度到50℃，再以700U/g 加入纖維素酶，在100W 超聲波功率下作用60min 后迅速升溫至90℃鈍化酶活10min，過濾得清液，離心取上清液，減壓濃縮至原體積三分之一時，加入三倍體積的95%乙醇沉淀多糖，靜置過夜，洗滌。將多糖沉淀復(fù)溶，反復(fù)脫蛋白、離心，最后冷凍干燥。

1.2.4 黑木耳多糖的純化［18-19］

1.2.4.1 脫蛋白 采用Sevage 法［20］，按照黑木耳多糖水溶液1/4 體積加入氯仿/正丁醇(5∶1)試劑［12］，劇烈振蕩30min，離心，傾出上清液，除去中間變性蛋白及下層氯仿，重復(fù)操作直至中間層無變性蛋白。再以4000r/min 離心10min，取上清液冷凍干燥。

1.2.4.2 脫色 采用H2O2法［21］，將多糖水溶液用氨水調(diào)pH 至8.0，40℃滴加5%H2O2，保溫(40℃)3h，以透析分子量8000～14000 的DM36 透析袋于室溫下透析4h，得黑木耳多糖。

1.2.4.3DEAE - 纖 維 素 柱 層 析［13，21］DEAE -Cellulose52(Cl-)經(jīng)濕法裝柱，用pH7.5 Tris-HCl 緩沖液平衡后，將脫蛋白、脫色后的多糖配成1%的溶液，上樣5mL，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，洗脫液為Tris-HCl +0.2mol/L NaCl，流速為0.5mL/min。用自動分部收集器收集洗脫液，每管收集5mL，將樣品收集液稀釋10 倍后用苯酚-硫酸法顯色，在490nm 下測定吸光度，計算多糖含量。以試管數(shù)目為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線圖。收集主峰部分溶液，真空濃縮，用蒸餾水透析，收集透析袋內(nèi)的多糖溶液，真空濃縮，冷凍干燥，備用。

1.2.5 黑木耳多糖抗凝血作用單因素實驗［22］本實驗選擇PT(凝血酶原時間)為檢測指標［23］，分別就多糖濃度、作用溫度、pH 對動物血漿體外抗凝時間的影響進行研究。動物血漿的制備:選擇雄性成年健康家兔，靜脈取血，用0.13mol/L 檸檬酸鈉抗凝(體積比3∶1)，3000r/min 離心10min，取上清血漿備用。

1.2.5.1 黑木耳多糖濃度對抗凝血作用的影響 將待測血漿分成5 組，每組0.50mL，分別加入2%、4%、6%、8%、10%的黑木耳多糖0.50mL，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)到pH7.4。對照組加入生理鹽水0.50mL。35℃溫育2min 后，加入兔腦促凝血酶原(按試劑說明書使用)，溫育2min，再加入20mmol/L CaCl20.1mL混合均勻，用凝聚儀記錄凝血酶原時間。

1.2.5.2 溫度對黑木耳多糖抗凝血作用的影響 將待測血漿分成5 組，每組0.50mL，加入10%的黑木耳多糖溶液0.50mL，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)到pH7.4，對照組加入生理鹽水0.50mL。35℃溫育2min 后，加入兔腦促凝血酶原(按試劑說明書使用)，溫育2min，再加入20mmol/L CaCl20.1mL 混合均勻，分別使待測樣品保持在20、25、30、35、40℃，用凝聚儀記錄凝血酶原時間。

1.2.5.3 pH 對黑木耳多糖抗凝血作用的影響 將待測血漿分成5 組，每組0.50mL，加入10%的黑木耳多糖溶液0.50mL，用磷酸鹽緩沖液分別調(diào)節(jié)樣品pH 到7.1、7.2、7.3、7.4、7.5，對照組加入生理鹽水0.50mL。35℃溫育2min 后，加入兔腦促凝血酶原(按試劑說明書使用)，溫育2min，再加入20mmol/L CaCl20.1mL混合均勻，用凝聚儀記錄凝血酶原時間。

1.2.6 黑木耳多糖抗凝血作用正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以凝血時間為考察指標，設(shè)計三因素三水平L9(33)的正交實驗，確定多因素綜合作用對黑木耳多糖抗凝血作用的影響。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.7 黑木耳多糖的測定方法及得率計算［24-25］粗多糖含量測定:采用苯酚-硫酸法。根據(jù)式(1)～式(2)計算多糖含量及多糖得率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS17.0 分析軟件對黑木耳多糖抗凝血作用進行ANOVA 單因素方差分析及Ducan’s 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法多糖提取率的比較

實驗結(jié)果采用SPSS 處理，得到葡萄糖標準曲線方程為Y =45.193X-0.0134(R2=0.9984)。選取最佳單因素提取條件下，計算多糖的提取率，比較四種提取方法對黑木耳多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取方法多糖提取率的比較Fig.1 The comparison of different extraction methods on polysaccharide extraction efficiency

堿液提取法容易使部分多糖發(fā)生水解，破壞多糖的活性結(jié)構(gòu)，降低多糖得率和不利于后續(xù)純化。超聲波法最大的優(yōu)點是用時短、操作簡單、效果明顯，但功率過大可能會破壞多糖的活性結(jié)構(gòu)，且長時間的超聲波作用在提高多糖溶出率的同時也帶出大量雜質(zhì)，使其與多糖相混而不易分開。采用超聲波復(fù)合酶提取法，其優(yōu)點是用時短，條件溫和，效果明顯，但超聲波場強的選擇要兼顧酶的活性要求。多糖得率可達19.14%，在四種提取方法中最高。

2.2 黑木耳多糖的純化

由圖2 可知，在490nm 處測定洗脫液的吸光度繪制洗脫曲線，多糖粗提液經(jīng)多次脫蛋白、脫色后沒有出現(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸的特征吸收峰?？芍?jīng)DEAE-纖維素柱層析分離后的多糖主要集中在8～16 管之間，即洗脫液36～80mL 之間，通過計算其純度可達到83.23%。

2.3 黑木耳多糖體外抗凝血作用的單因素實驗

2.3.1 黑木耳多糖濃度對抗凝血作用的影響 由表2 可以看出，35℃、pH7.4 的條件下，在實驗范圍內(nèi)，檢測體系中黑木耳多糖的濃度越高其抗凝血作用也越強，這與相關(guān)文獻報道一致。當多糖濃度達到10%，凝血時間比對照組提高了2.5 倍左右。

2.3.2 溫度對黑木耳多糖抗凝血作用的影響 由表3 可以看出，在10% 多糖濃度、pH7.4 的條件下，隨著測定溫度的升高，抗凝血作用隨之加強。若溫度繼續(xù)升高，則失去了模擬生物體體溫的意義，故選擇35℃條件下的實驗結(jié)果作為后續(xù)實驗的參考。

圖2 黑木耳多糖DEAE-52 纖維素柱層析洗脫曲線Fig.2 Chromatography of polysaccharides from Auricularia auricular on DEAE-52 cellulose

表2 不同濃度下黑木耳多糖的抗凝血作用Table 2 Anticlotting function of polysaccharides from Auricularia auricular on different concentration

表3 不同溫度下黑木耳多糖的抗凝血作用Table 3 Anticlotting function of polysaccharides from Auricularia auricular on different temperature

2.3.3 pH 對黑木耳多糖抗凝血作用的影響 由表4可以看出，在35℃、10%多糖濃度下，pH 對黑木耳多糖血漿抗凝時間有著顯著影響。結(jié)果表明，在pH7.4時，黑木耳多糖抗凝血效果最好。其原因可能是在pH7.4 時能保證家兔血漿正常的電離平衡和多糖活性所需的構(gòu)象，這與國內(nèi)外的相關(guān)報道一致。

表4 不同pH 下黑木耳多糖的抗凝血作用Table 4 Anticlotting function of polysaccharides from Auricularia auricular on different pH

2.4 黑木耳多糖抗凝血作用正交實驗結(jié)果

綜合以上單因素實驗結(jié)果，以PT 為考察指標進行三因素三水平的正交實驗，找出多因素綜合作用下多糖對抗凝血作用的最佳因素組合，見表5。

表5 正交實驗結(jié)果Table 5 The result of orthogonal test

由表5 正交實驗結(jié)果極差分析可以看出，影響黑木耳多糖體外抗凝血作用的強弱因素依次為A ＞B ＞C，即黑木耳多糖濃度＞溫度＞pH。由直觀分析可知，最優(yōu)條件組合為A3B3C2，即多糖濃度為10%、溫度為35℃、pH 為7.4，在此條件下的凝血時間可以達到41.6s。在此條件下進行驗證性實驗，抗凝血時間可達到41.8s，這與直觀分析得到最優(yōu)條件組合相近。

3 結(jié)論

3.1 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取黑木耳多糖是目前應(yīng)用較廣、效果較好的提取方法:本實驗采用在料液比1∶50(w/v)，調(diào)節(jié)pH 至5.0，按每克原料加入500U 的果膠酶，選擇45℃、超聲波功率150W 條件下酶解60min;升溫滅酶后調(diào)節(jié)pH 至7.5，再按每克原料加入700U 的纖維素酶，選擇50℃、超聲波功率100W條件下酶解60min 的提取方法提取黑木耳多糖，提取率可達到19.14%。與傳統(tǒng)方法相比，該方法縮短了提取時間，提高了多糖的提取率。

3.2 黑木耳多糖粗體物經(jīng)脫蛋白、脫色和DEAE-纖維素柱層析后，通過真空冷凍干燥可使黑木耳多糖純度達到83.23%。

3.3 黑木耳多糖體外抗凝血作用經(jīng)單因素實驗和正交實驗可知在外界多因素綜合影響下，黑木耳多糖體外抗凝血作用的最佳因素組合為:多糖濃度為10%、pH7.4、溫度35℃，PT 值可達到41.8s。

［1］Zhang Hua，Wang Zhen yu.In vitro antioxidant activities of sulfated derivatives of polysaccharides extracted from Auricularia auricular［J］.International Journal of Molecular Sciences，2011，12(5):3288-3302.

［2］葉挺梅，錢令波，崔潔，等.黑木耳多糖對抗離體心臟缺血/再灌注損傷的研究［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2010，26(2):154-158.

［3］Li Ling，Ding Jun-nan，Luo Li，et al.Preliminary studies on the early quality identification of Auricularia auricular［J］.Journal of Forestry Research，2005，16(1):61-64.

［4］陳和生，孫振亞.黑木耳多糖的研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2003，14(5):300-301.

［5］王淑如，王丁剛.茶葉多糖的抗凝血及抗血栓作用［J］.中草藥，1992，23(5):254-256.

［6］包立軍，張劍韻，黃龍全.桑葉中抗凝血活性成分的初步分離與純化［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2006，32(3):418-421.

［7］孫妹蘭，萬牲，劉月.玉米芯水溶性多糖的分離純化和抗凝血活性研究［J］.分子科學(xué)學(xué)報，2006，22(2):131-133.

［8］鄭靜，常遁滔，林英，等.超聲波法和超聲波酶法提取靈芝多糖的條件和研究［J］.食用菌報，2006，13(1):48-52.

［9］樊黎生，張聲華.黑木耳粗多糖的分離提取工藝及其理化性能研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(8):100-103.

［10］歐陽天賢.堿溶性黑木耳多糖的分離、純化和表征［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，18(1):46-48.

［11］李鐘玉，張京東，李臨生.超聲波法提取靈芝多糖的研究［J］.中國食用菌，2004，23(2):42-44.

［12］劉立梅.黑木耳多糖的分別酶解法提取及脫蛋白工藝研究［J］.中國釀造，2009(3):124-126.

［13］韓春然，唐娟，馬永強.黑木耳多糖的酶法提取、純化及性質(zhì)研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(2):53-55.

［14］婁在祥，張有林，王洪新.超聲波協(xié)同酶法提取黑木耳多糖［J］.食品工業(yè)，2007(1):29-32.

［15］何澤超.纖維素的酶水解及超聲波對其加速作用的研究［D］.成都:四川大學(xué)，2001.

［16］于淑娟，高大維，李國基.超聲波酶法提取靈芝多糖的機理研究［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2001(4):65-68.

［17］張立娟，于國萍，周國華.黑木耳多糖酶法提取條件的研究［J］.食品與開發(fā)，2005，26(3):89-91.

［18］樊黎生.黑木耳多糖AAP-IIa 級分的制備及其生物活性的研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［19］趙鑫.黑木耳分級多糖抗氧化活性及其相關(guān)生理功能研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2011.

［20］齊慧玲，魏紹云，王繼倫，等.Sevage 法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000(3):20-21.

［21］倪德江.烏龍茶多糖的形成特征、結(jié)構(gòu)、降血糖作用及其機理［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003:57.

［22］梁進.茶葉多糖的化學(xué)修飾及體外抗凝血作用研究［D］.合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［23］王學(xué)峰，王鴻利.血栓與止血的檢測及應(yīng)用［M］.上海:世界圖書出版公司，2002:164-184.

［24］王欽德，楊堅.食品實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003:330-361.

［25］S.Suzanne Nielsen.食品分析［M］.北京:中國工業(yè)出版社，2002:118-121.