辣椒素對(duì)腸道菌體外發(fā)酵的影響

任文瑾，呂 嬌，蘇昕峰，劉 雄

(重慶西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶北碚400715)

辣椒素(capsaicin)分子式為C18H27NO3，其化學(xué)名稱為反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺，是辣椒風(fēng)味中的主要成分。辣椒味辛、性熱，入心、脾二經(jīng)，有溫中散寒、開胃消食的功效，對(duì)治療寒滯腹痛、嘔吐、瀉痢等有著一定功效并且對(duì)胃痛、胃脹及消化不良等有很好的調(diào)理作用［1-2］。辣椒素藥理作用廣泛，在鎮(zhèn)痛方面有重要作用［3-5］，同時(shí)具有防治心血管疾?。?］、呼吸道疾?。?］的作用，還能用于減肥［8］、治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［9］、銀屑?。?0］等。辣椒素是一種?；南悴菟嵬赐滴?，其受體為香草酸受體亞型(vanilloid receptor1，VR1)。VR1 在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)水平最高［11］，在膀胱、子宮、鼻粘膜、呼吸道和結(jié)腸等部位都檢測(cè)出辣椒素受體。VR1 可參與胃腸道消化液分泌，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)［12］，對(duì)腸道健康有重要作用。但也有研究表明辣椒素對(duì)人體腸道有不良影響。Hammer 等［13］報(bào)道給健康人灌胃辣椒素會(huì)即刻產(chǎn)生腹部痙攣和疼痛現(xiàn)象。Johnson［14］研究發(fā)現(xiàn)對(duì)斷奶大鼠喂食8 周5%的辣椒素會(huì)引起胃腸管道角質(zhì)化和侵蝕斑。有報(bào)道稱［15］，飼喂辣椒素的大鼠大腸末端和末端小腸、肝臟及大腸內(nèi)容物中會(huì)產(chǎn)生類似飼喂1，2-二甲基肼的現(xiàn)象，釋放有毒物質(zhì)。大量研究表明，腸道健康與短鏈脂肪酸產(chǎn)量、腸道pH、氨和苯酚濃度、次級(jí)膽汁酸分泌和糞水中細(xì)胞毒素含量、排空時(shí)間及腸道菌活性等方面相關(guān)［16］。體外實(shí)驗(yàn)表明辣椒素有較強(qiáng)的抑菌效果，那么它能否抑制人體腸道菌群，影響其正常分布，進(jìn)而影響腸道發(fā)酵環(huán)境是值得研究的一個(gè)問題。體外發(fā)酵作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充有很多優(yōu)點(diǎn):可以跟蹤發(fā)酵過程中物質(zhì)的變化及研究發(fā)酵產(chǎn)物的形成過程，彌補(bǔ)了體內(nèi)發(fā)酵不能實(shí)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的缺點(diǎn);還可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，重復(fù)性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)擬采用體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)觀察辣椒素對(duì)腸道發(fā)酵環(huán)境的影響，以期為辣椒的科學(xué)消費(fèi)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD 大鼠 重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司;天然辣椒素 河南倍特生物科技有限公司，辣椒總堿含量95.7%;氯化鈉、苯酚、次氯酸鈉、冰乙酸、亞硝基鐵氰化鈉、吐溫80、氯化銨、氫氧化鈉 成都市科龍化工試劑廠，分析純;硫酸 成都市科龍化工試劑廠，ρ =1.84g/mL，優(yōu)級(jí)純;乙酸 A Johnson Matthey Company，色譜級(jí);巴豆酸、丙酸、丁酸、異丁酸 梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司，色譜純;伊紅-美蘭瓊脂培養(yǎng)基(EMB) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司，生物試劑;雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基(BS)、乳酸菌選擇性培養(yǎng)基(LBS) 青島海博生物技術(shù)有限公司，生物試劑;高純二氧化碳?xì)怏w 重慶朝陽(yáng)氣體有限公司，99.999%。

Sepctrumlab 22 可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;WH-1 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠;JA2003A 電子天平 上海精天電子儀器有限公司;DHG-9070 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C 精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司;5810 型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;SIGMA 低溫離心機(jī) 德國(guó)SIGMA 公司;ARI14紫外分光光度計(jì) 上海愛朗儀器有限公司;GC-2010氣相色譜 日本島津公司;KQ-100 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HH-B11 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;BC-J160S 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ES - 315 高壓蒸汽滅菌鍋KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC;ZHWY - 100C 恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;Stabilwax-DA毛細(xì)色譜柱 美國(guó)RESTEK 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液制備

1.2.1.1 發(fā)酵液配比 查閱相關(guān)文獻(xiàn)及前期的實(shí)驗(yàn)表明，辣椒素引起的大鼠血脂變化及腸道損傷與灌喂劑量相關(guān)。體外發(fā)酵液配比見表1。

表1 發(fā)酵液配比Table 1 Compounds of each fermentation liquid

1.2.1.2 體外發(fā)酵步驟 a.于無(wú)菌條件下取出6 只雄性大鼠的盲腸內(nèi)容物，稱量8g 內(nèi)容物裝入預(yù)先滅菌的50mL 帶蓋離心管中，稱重，鼓入高純CO2氣體5min，蓋上蓋子待用。

b.用9 倍(V:m)無(wú)菌生理鹽水稀釋盲腸內(nèi)容物，渦旋震蕩5min 混勻，4 層紗布過濾。

c.取12 支100mL 高溫滅菌后的高溫瓶，每支高溫瓶中加入5mL 盲腸內(nèi)容物濾液和45mL 滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)液(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，定容至1000mL，pH7.0 ～7.2)，將高溫瓶分為4 組(每組3支)，分別加入0、2.5、5.0、7.5mg 辣椒素，配制成辣椒素濃度分別為0、0.05%、0.1%、0.15%的發(fā)酵液(見表1)，鼓入高純CO2氣體20min，蓋好橡膠塞后蠟封。在60～80r/min 轉(zhuǎn)速的恒溫培養(yǎng)振蕩器上37℃搖床培養(yǎng)10h，終止發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵液的pH、游離氨、SCFA 及微生物。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 pH 測(cè)定 取發(fā)酵液樣品5mL 于4000r/min下離心5min，吸取上清液2mL，用精密酸度計(jì)測(cè)上清液pH。

1.2.2.2 發(fā)酵液游離氨測(cè)定 無(wú)氨水制備［17］:在1000mL 蒸餾水中，加入0.10mL 硫酸(ρ =1.84g/mL)，并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去前50mL 餾出液，然后將餾出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。

將發(fā)酵液樣品于4000r/min 下離心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL 含有0.001mol/L 亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L 苯酚溶液和1mL 含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L 氫氧化鈉溶液，60℃保溫5min，于625nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度［18］。

配制5mmol/L 氯化銨溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0mL 溶液于4mL 比色皿中，用無(wú)氨水稀釋至1.0mL，按上述步驟測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1 氯化銨標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ammonium chloride

1.2.2.3 發(fā)酵液SCFA 測(cè)定 將盲腸內(nèi)容物發(fā)酵液樣品在4000r/min 轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至超純水預(yù)處理過的10mL 離心管中，10000r/min轉(zhuǎn)速下繼續(xù)離心15min，1mL 一次性注射器吸取上清液1mL，0.22μm 濾膜過濾至2mL 進(jìn)樣小瓶中待測(cè)［19］。

氣相色譜條件:進(jìn)樣量1μL;進(jìn)樣口溫度220℃;柱流量0.95mL/min，柱溫90℃、平衡時(shí)間0.5min，5℃/min 升溫至150℃，保留時(shí)間7min;檢測(cè)器溫度230℃;氫氣流量40mL/min，空氣流量400mL/min，尾吹流量40mL/min［20］。

1.2.2.4 發(fā)酵液微生物測(cè)定 取發(fā)酵液1mL，加入9mL 無(wú)菌生理鹽水，依次10 倍稀釋至10-7。選擇10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度，用于大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)，接種量為100μL。大腸桿菌培養(yǎng)選用EMB 培養(yǎng)基，37℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h 計(jì)數(shù)。雙歧桿菌和乳酸桿菌分別選用BS 培養(yǎng)基和LBS 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿蠟封后，37℃下二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)72h 計(jì)數(shù)。結(jié)果以lg cfu/mL 表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS17.0 軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組結(jié)果采用Duncan 顯著性差異測(cè)驗(yàn)進(jìn)行單向方差分析，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒素對(duì)腸道菌發(fā)酵液pH 的影響

辣椒素劑量對(duì)腸道菌體外發(fā)酵液pH 的影響結(jié)果見圖2。

圖2 辣椒素劑量對(duì)發(fā)酵液pH 的影響Fig.2 Effect of capsaicinoids on pH value in fermentation liquids

從圖2 可以看出，添加辣椒素升高了發(fā)酵液的pH，并且pH 的升高與辣椒素添加劑量呈正相關(guān)。與空白組相比，添加0.15%辣椒素組發(fā)酵液pH 顯著升高(p ＜0.05)。影響發(fā)酵液pH 的主要是發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸和游離氨，pH 升高表明發(fā)酵液中有機(jī)酸含量可能降低或游離氨濃度升高。

2.2 辣椒素對(duì)腸道菌發(fā)酵液游離氨含量的影響

辣椒素劑量對(duì)腸道菌體外發(fā)酵液中游離氨濃度的影響結(jié)果見圖3。

圖3 辣椒素劑量對(duì)發(fā)酵液游離氨濃度的影響Fig.3 Effect of capsaicinoids on free ammonia concentration in fermentation liquids

從圖3 可以看出:辣椒素提高了腸道菌發(fā)酵液中游離氨的濃度，且隨著辣椒素添加量的增大，游離氨濃度相應(yīng)增高，表現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)。與空白組比較，添加0.10%和0.15%辣椒素劑量組的發(fā)酵液中游離氨濃度都顯著升高(p ＜0.05)，其中添加0.15%辣椒素組比空白組高出20%，達(dá)到了極顯著水平(p ＜0.01)。這與發(fā)酵液中pH 的升高相一致。

2.3 辣椒素對(duì)腸道菌發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的影響

辣椒素劑量對(duì)腸道菌體外發(fā)酵液中短鏈脂肪酸濃度的影響結(jié)果見圖4。從圖中可以看出:辣椒素的添加顯著降低了發(fā)酵液中總SCFA 以及乙酸、丙酸和丁酸的含量(p ＜0.05)，并且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。辣椒素添加量0.10%和0.15%兩組發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量極顯著降低(p ＜0.01)。此結(jié)果表明，添加辣椒素會(huì)導(dǎo)致腸道發(fā)酵中有機(jī)酸的產(chǎn)生量降低，這可能是由于它抑制了腸道益生菌對(duì)碳水化合物的發(fā)酵。

圖4 辣椒素劑量對(duì)發(fā)酵液中短鏈脂肪酸濃度的影響Fig.4 Effect of capsaicinoids on the concentration of SCFA in fermentation liquids

2.4 辣椒素對(duì)腸道菌發(fā)酵液微生物的影響

辣椒素劑量對(duì)腸道菌體外發(fā)酵液中乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果見圖5～圖7。從圖5、圖6 中可以看出:隨著培養(yǎng)液中辣椒素添加量的增加，發(fā)酵液中乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量顯著降低，并表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。與空白組相比，培養(yǎng)基中添加0.05%辣椒素就會(huì)顯著抑制乳酸桿菌的生長(zhǎng)(p ＜0.05)，當(dāng)辣椒素添加量增加到0.15%，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量極顯著減少(p ＜0.01)。觀察圖7 可知:隨著辣椒素劑量增加，發(fā)酵液中大腸桿菌數(shù)量明顯升高，與空白組比，添加0.15%辣椒素的發(fā)酵液中大腸桿菌數(shù)量的增加達(dá)到了極顯著水平(p ＜0.01)。

圖5 辣椒素劑量對(duì)發(fā)酵液中乳酸桿菌的影響Fig.5 Effect of capsaicinoids on the amount of Lactobacillus in fermentation liquids

3 結(jié)論與討論

正常人體大腸中含有約1013～1014個(gè)微生物，它們對(duì)維持腸道正常的生理功能具有重要作用。腸道中SCFA 產(chǎn)量、pH、氨和苯酚濃度、次級(jí)膽汁酸產(chǎn)量和腸道微生物活性都與腸道健康息息相關(guān)，而腸道微生物組成和活性直接影響SCFA、游離氨和次級(jí)膽汁酸的濃度。有研究表明，腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)(雙歧桿菌下降，大腸桿菌、梭菌大量繁殖)，尿素合成受阻，會(huì)產(chǎn)生更多的氨［21-22］。在游離氨濃度升高和短鏈脂肪酸濃度下降的綜合作用下，盲腸內(nèi)容物pH 升高，pH的改變反過來影響盲腸內(nèi)容物中微生物的生長(zhǎng)。

圖6 辣椒素劑量對(duì)發(fā)酵液中雙歧桿菌的影響Fig.6 Effect of capsaicinoids on the amount of Bifidobacterium in fermentation liquids

圖7 辣椒素劑量對(duì)發(fā)酵液中大腸桿菌的影響Fig.7 Effect of capsaicinoids on the amount of Enterobacter in fermentation liquids

在機(jī)體中未消化的多糖、低聚糖、蛋白質(zhì)、肽和糖蛋白等食物殘?jiān)M(jìn)入大腸，被腸道微生物進(jìn)一步分解發(fā)酵，糖類發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸和氣體(CO2、CH4、H2等)，含氮化合物被微生物發(fā)酵產(chǎn)生游離氨、苯酚等產(chǎn)物。因此，進(jìn)入大腸的食物殘?jiān)煞种苯佑绊懩c道發(fā)酵產(chǎn)物和腸道菌群分布。膳食纖維多為益生因子，有利于腸道中乳酸菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生豐富的SCFA，改善腸道pH，促進(jìn)腸細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制結(jié)腸癌等。Soile M.Gr?sten 等研究表明，高膳食纖維的黑麥面包可以增加絕經(jīng)期婦女腸道微生物活性，提高β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶和脲酶的活性，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，增加排便量和糞便中短鏈脂肪酸的濃度，而對(duì)腸道微生物的組成沒有任何不利影響［23］。

本研究結(jié)果表明，辣椒素能抑制有益微生物乳酸桿菌、雙歧桿菌的繁殖，降低SCFA 產(chǎn)量，提高游離氨濃度，升高pH，進(jìn)而提供有利于有害菌大腸桿菌生長(zhǎng)的環(huán)境。辣椒素對(duì)腸道健康有一定的不利作用，可能會(huì)損害腸道健康，且這種損害與攝入劑量呈正相關(guān)，因此在日常飲食中控制辣椒的攝入量是十分必要的。此外，我國(guó)食辣人群眾多，通過添加腸道益生因子、調(diào)整膳食組成，以緩解或改善食用辣椒引起的腸道損傷具有廣泛的社會(huì)意義，值得進(jìn)一步深入研究。

［1］Surh YJ，Lee SS.Capsaicin in hot chili pepper:carcinogen，cocarcinogen or anticarcinogen?［J］.Fed Chem Toxic，1996，34:313-316.

［2］王峰，譚興和，張禮紅，等.辣椒的主要生理功能及開發(fā)利用［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2006(6):17-20.

［3］郭峰，趙云富，姜曉鐘，等.辣椒素局部用藥對(duì)初級(jí)傳入神經(jīng)和P 物質(zhì)的影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(4):423-426.

［4］Gamse R，Holzer P，Lembeck F.Decrease of substance P in primary afferent neurons and impairment of neurogenic plasma extravasation by capsaicin ［J］.Br J Pharmacol，1980，68(2):207-213.

［5］Jessell TM，Iversen LL，Cuello AC. Capsaicin - induced depletion of substance P from primary sensory neurons［J］.Brain Res，1978，152(1):183-188.

［6］Gomez AA，Quitoga P，Rbolledo A，et al. Chronotropic，inotropic and lusitropic effects of capsaicin on isolated rat atria［J］. Acta Physiol Pharmacol Ther Latinoam，1998，48 (2):65-72.

［7］時(shí)翠芹.辣椒素咳嗽敏感性及氣管炎癥測(cè)定在慢性咳嗽中的意義［D］.上海:同濟(jì)大學(xué)，2007.

［8］張莉莉.辣椒素及其受體TRPV1 預(yù)防肥胖的機(jī)制研究［D］.重慶:第三軍醫(yī)大學(xué)，2006.

［9］楊梅香.紅辣椒治療關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.北京針灸骨傷學(xué)院學(xué)報(bào)，1994(1):61-64.

［10］張愛軍，李興華，王美納，等.辣椒素對(duì)銀屑病小鼠模型的作用［J］.中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2004(6):333-335.

［11］Rachel JAH，Linda MM，Melanie C，et al. Capsaicin sensitivity is associated with the expression of the vanilloid(capsaicin)receptor(VR1)mRNA in adult rat sensory ganglia［J］.Neuroscience Letters，1998，250(3):177-180.

［12］Ulrike HP，Helmut S，F(xiàn)red L.Effect of capsaicin on gastric corpus smooth muscle of the rat capsaicin ［J］.Gut，2004，53:109-116.

［13］Hammer J，Hammer HF，Eherer AJ，et al. Intraluminal capsaicin does not affect fluid and electrolyte absorption in the human jejunum but does cause pain［J］.Gut，1998，43:252-255.

［14］Johnson WJ. Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract，capsicum annuum fruit extract，capsicum annuum resin，capsicum annuum fruit powder，capsicum frutescens fruit，capsicum frutescens fruit extract，capsicum frutescens resin，and capsaicin ［J］.Inter J Toxic，2007，26:3-106.

［15］Nalini N，Sabitha K，Viswanathan P，et al.Influence of spices on the bacterial(enzyme)activity in experimental colon cancer［J］.Journal of Ethnopharmacology，1998，62(1):15-24.

［16］Bugaut M，Bentejac M.Biological effects of short-chain fatty acids in nonruminant mammals［J］.Annu Rev Nutr，1993;13:217-241.

［17］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB 11894-89 水質(zhì)總氮的測(cè)定［S］.國(guó)家環(huán)境保護(hù)局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)，2003.

［18］Chaney AL，Marbach EP.Modified reagents for determination of urea and ammonia［J］.Clinical Chemistry，1962，8:130-132.

［19］Kishida T，Nakai Y，Ebihara K.Hydroxypropyl- distarch phosphate from tapioca starch reduces zinc and iron absorption，but not calcium and magnesium absorption，in rats［J］.J Nutr，2001，131:294-300.

［20］蘇昕峰，向晨茜，文紅麗，等.辣椒素灌喂劑量對(duì)大鼠腸道發(fā)酵產(chǎn)物的影響［J］.2011 年中國(guó)農(nóng)業(yè)工程學(xué)會(huì)農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國(guó)食品科學(xué)與工程博士生學(xué)術(shù)論壇管產(chǎn)學(xué)研助推食品安全重慶高峰論壇，2011:136-140.

［21］小橋恭一.從消化道微生態(tài)學(xué)說起［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，1995(7):36-42.

［22］Kuda T，Iwai A，Yano T.Effect of red pepper Capsicum annuum var.conoides and garlic Allium sativum on plasma lipid levels and cecal microflora in mice fed beef tallow［J］.Food and Chemical Toxicology，2004，42(10):1695-1700.

［23］Soile M Gr?sten，Katri S Juntunen，Jaana M?tt?.High-fiber rye bread improves bowel function in postmenopausal women but does not cause other putatively positive changes in the metabolic activity of intestinal microbiota［J］. Nutrition Research，2007(27):454-461.