蛹蟲草子實(shí)體多糖抗突變作用

郭麗新，馮 哲，魏博洋，齊 彥，王世龍，趙 敏

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010)

蛹蟲草(Cordyceps militaris(L.ex Fr)Link)，又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草在分類學(xué)上同屬于真菌門(Eumycota)，子囊菌亞門(Ascomycotina)，核菌綱(Pyrenomycetes)，球殼目(Sphaeriales)，麥角菌科(claviticpitaceae)蟲草屬(Coedyceps)［1］，是一種具有藥用及滋補(bǔ)功效的珍貴藥材。其“性平、味甘、益肺腎、補(bǔ)精髓、止血化痰”［2］，多用來治療肺結(jié)核、老人畏寒、咳嗽、產(chǎn)婦及老人貧血虛弱、自汗盜汗、腰膝酸痛、神經(jīng)衰弱、咳血、吐血等?，F(xiàn)代研究表明，蛹蟲草具有抗腫瘤［3］、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫［4-5］，調(diào)節(jié)血糖等作用。李志等采用灌胃給藥的方式對人工蛹蟲草子實(shí)體水提物和醇提物對小鼠骨髓細(xì)胞微核率、小鼠精子崎形率的影響研究，以及通過體外對中國地鼠肺細(xì)胞株(CHL)細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗，結(jié)果顯示其人工蛹蟲草子實(shí)體提取物未發(fā)現(xiàn)具有致突變作用［6］。突變是生物機(jī)體的遺傳物質(zhì)所發(fā)生的可遺傳的變異?，F(xiàn)代研究表明，許多嚴(yán)重危害人類健康的疾病如腫瘤、某些退行性病變以及衰老的發(fā)生都與突變作用有關(guān)。應(yīng)用抗突變藥物來降低人體自身正常細(xì)胞和染色體的突變率，對于人類生命的健康有著深遠(yuǎn)意義。本項目研究蛹蟲草子實(shí)體多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成及染色體畸變率的影響，探討蛹蟲草多糖抗突變活性，為抗腫瘤等作用研究提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級昆明種小白鼠，體重(20 ±2)g，雌雄各半 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供;蛹蟲草 東北林業(yè)大學(xué)微生物教研室提供;CMPS 注射液 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室制備;環(huán)磷酰胺 Sigma公司;秋水仙素 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯化鉀、冰醋酸等均為分析純。

CHK-213 型生物顯微鏡日本奧林巴斯;AB204-N 電子分析天平;S.HH.W21-600 三用電熱恒溫水浴箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;LDZ4-0.8 離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗 將實(shí)驗小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只:空白對照組、CTX 組和CMPS1、CMPS2、CMPS3 三個劑量組?？瞻讓φ战M和CTX 組第1 ～10d 分別肌肉注射生理鹽水，CMPS1、CMPS2、CMPS3 組按25、50、100mg/kg 的劑量注射。CTX 組和CMPS 三組于第9、10d 腹腔注射環(huán)磷酰胺(環(huán)磷酰胺40mg/kg)，于第10d 注射CTX 6h 后，頸椎脫臼法處死小鼠，分離雙側(cè)股骨，剔凈肌肉，剪去股骨頭，用5mL 注射器抽取3mL 生理鹽水沖洗骨髓細(xì)胞，1000r/min 離心5min，棄去上清液，重懸細(xì)胞。常規(guī)制片，每只小鼠骨髓細(xì)胞涂3 張片子，編號，晾干，甲醇固定，1∶9 Giemsa 染色，油鏡觀察。選擇細(xì)胞完整、分散均勻、著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，采用雙盲法計數(shù)，每只小鼠計數(shù)1000 個嗜多染紅細(xì)胞，并計數(shù)微核細(xì)胞(MN)數(shù)，計算微核千分率(MN‰)并按公式計算抑制率:

抑制率(%)=(陽性組MN 數(shù)-實(shí)驗組MN 數(shù))/陽性組MN 數(shù)×100，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較用t 檢驗。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗 實(shí)驗動物品種、分組和前期處理方法同微核實(shí)驗，最后，注射CTX 2h 后，腹腔注射秋水仙素(4μg/g)，4h 后采用頸椎脫臼法處死小鼠，取雙側(cè)股骨，剔凈肌肉，剪斷股骨頭，用注射器吸生理鹽水沖洗骨髓細(xì)胞入離心管內(nèi)，用吸管吹打均勻，1000r/min 離心8min，棄上清液后向離心管內(nèi)加入9mL 0.075mol KCL 溶液，用吸管吹打均勻呈細(xì)胞懸液，置37℃水浴箱內(nèi)低滲處理30min，固定，常規(guī)制片，玻片晾干，1 ∶9 Giemsa 染色8min，油鏡觀察。每只動物計數(shù)100 個分散良好、著色清晰的中期分裂相細(xì)胞，記錄染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常的細(xì)胞。各組數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較用t 檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 CMPS 對CTX 誘發(fā)小鼠骨髓PCE 微核的影響

2.1.1 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的細(xì)胞學(xué)特征油鏡下觀察嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色，微核多為單個的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈藍(lán)紫色，直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5(圖1a)。經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后的小鼠骨髓細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞出現(xiàn)的微核細(xì)胞數(shù)增多，在1 個視野中，可連續(xù)2 個細(xì)胞同時出現(xiàn)微核(圖1b)。

圖1 小鼠骨髓微核圖(Giemsa 染色，×100)Fig.1 Micronuclei in mice bone marrow PCE

2.1.2 蛹蟲草多糖對CTX 誘發(fā)的小鼠骨髓PCE 微核率的影響 圖2 顯示，蛹蟲草多糖各劑量組可降低CTX 誘導(dǎo)的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率，CMPS三個劑量組小鼠微核抑制率分別為29.75%、36.20%、44.48%，抑制率隨劑量增多呈增加趨勢，各劑量組與環(huán)磷酰胺組比較，均有顯著性差異(p ＜0.05)。

圖2 小鼠骨髓PCE 微核率及抑制率Fig.2 Micronucleus rate and inhibition rates of PCE of bone marrow cells in mice

微核的形成是細(xì)胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學(xué)終點(diǎn)，凡能使染色體發(fā)生斷裂，并延遲到細(xì)胞分裂后期，或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)遭到破壞的遺傳損傷，都可用微核實(shí)驗來檢測［7］，觀察細(xì)胞微核數(shù)的多少能判斷染色體復(fù)制與有絲分裂這兩個過程是否出現(xiàn)異常。因此，微核常作為化學(xué)物質(zhì)是否有致突變性的一項觀察指標(biāo)，在對外來化合物(如藥品、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境污染等)遺傳毒性和職業(yè)暴露人群遺傳損害檢測以及生態(tài)環(huán)境檢測方面［8］，都有大量的應(yīng)用。哺乳動物紅細(xì)胞在成熟過程中能把主核排出胞外，微核滯留在胞內(nèi)，易于識別，結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。

2.2 蛹蟲草多糖對CTX 誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變的影響

由圖3 可知，經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后，小鼠骨髓細(xì)胞的染色體畸變的細(xì)胞學(xué)特征，主要表現(xiàn)為染色體的斷裂、環(huán)化和部分缺失。環(huán)磷酰胺為氮芥類衍生物，進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可代謝為醛磷酰胺、磷酰胺氮芥等，與DNA 發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，損傷DNA、染色體結(jié)構(gòu)與功能，使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷，小鼠骨髓PCE 染色體發(fā)生斷裂等，具有遺傳毒性作用。

圖3 小鼠骨髓細(xì)胞染色體Fig.3 Chromosomes of bone marrow cells in mice

由圖4 可知，CMPS 三個劑量組染色體畸變率分別為36.7% ± 5.46%、20.8% ± 3.52%、18.1% ±3.28%，畸變率隨CMPS 劑量增多呈下降趨勢，高劑量組畸變率較低，CMPS 三組與CTX 組比較，均有顯著性差異(p ＜0.05)。

圖4 各組小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率Fig.4 chromosome aberration rates of bone marrow cells in mice

骨髓細(xì)胞染色體畸變分析實(shí)驗觀察的是分裂間期與前期的細(xì)胞染色體畸變，可反映諸如斷片、裂隙、環(huán)狀染色體、多倍體等多種畸變結(jié)果，且結(jié)果可靠，能夠直接反應(yīng)骨髓細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率的高低，可判斷受試物是否具有突變作用［9］。

微核實(shí)驗、染色體畸變實(shí)驗是目前廣泛應(yīng)用的經(jīng)典檢測染色體損傷的技術(shù)，包括了細(xì)胞水平和染色體水平的檢測范圍。微核和染色體畸變存在著直接相關(guān)關(guān)系，但又不等同，微核反應(yīng)部分染色體結(jié)構(gòu)畸變，這里主要指不穩(wěn)定性畸變;除染色體畸變的斷片可形成微核外，染色單體斷裂、單條或多條滯后的染色體也可形成微核，而染色體畸變實(shí)驗?zāi)茉谛螒B(tài)上更確切地觀察到染色體受損情況，在遺傳毒物篩選中這兩種檢測方法經(jīng)常被采用。

環(huán)磷酰胺作為一種誘變劑可以誘導(dǎo)微核和染色體畸變的形成，在使用誘變劑的同時，給予蛹蟲草多糖，觀察其抗突變的作用。本項目微核實(shí)驗研究結(jié)果顯示空白對照組的微核率為1.90‰，處于自發(fā)突變的1‰～3‰的范圍內(nèi)。蛹蟲草多糖三個劑量組對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓PCE 微核形成均具有明顯的抑制作用，與環(huán)磷酰胺組比較，具有顯著性差異(p ＜0.05);小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變分析實(shí)驗結(jié)果顯示蛹蟲草多糖三個劑量組對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變率有降低作用，與環(huán)磷酰胺組比較具有顯著性差異(p ＜0.05)。微核實(shí)驗、染色體畸變實(shí)驗結(jié)果表明蛹蟲草多糖可降低環(huán)磷酰胺對染色體的損傷，具有抗突變活性，提示蛹蟲草多糖對接受致突變物質(zhì)者具有很好的防護(hù)作用，結(jié)合蛹蟲草多糖增強(qiáng)免疫等保健作用，提示蛹蟲草、蛹蟲草多糖具有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

蛹蟲草多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的體內(nèi)微核形成及染色體的損傷具有減輕作用，具有一定的抗突變活性。蛹蟲草多糖在抗腫瘤，阻止遺傳物質(zhì)損傷等方面具有很好的作用。

［1］曾宏彬，宋斌，李泰輝.蛹蟲草研究進(jìn)展及其產(chǎn)業(yè)化前景［J］.食用菌學(xué)報，2011，18(2) :70-74.

［2］吳征鎰.新華本草綱要［M］.上海.上?？萍汲霭嫔?，1986:6.

［3］樊慧婷，林洪生，李杰，等.人工蛹蟲草子實(shí)體對Lewis 肺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的影響［J］.中華腫瘤防治雜志，2009，16(15) :1130-1134.

［4］Lin R，Liu H，Wu S，et al.Production and in vitro antioxidant activity of exopolysaccharide by a mutant，Cordyceps militaris SU5-08［J］.Int J Biol Macromol，2012，51(1-2) :153-7.

［5］張安寧，袁書林.不同劑量蛹蟲草菌絲體對大鼠免疫功能的影響［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(3) :30-34.

［6］李志，黃俊明，楊穎，等.人工蛹蟲草子實(shí)體不同提取物的致突變作用［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2010，27(11) :698-700.

［7］杜峰濤，李林.細(xì)胞微核形成機(jī)制探討［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，22(4) :19-22.

［8］Ellahue?e MF，Pérez-Alzola LP，Olmedo MI.Chronic ethanol consumption in mice does not induce DNA damage in somatic or germ cells，evaluated by the bone marrow micronucleous assay and the dominant lethal mutation assay［J］.Biological Research，2012，45(1) :27-31.

［9］劉世清，熊文，杜予民，等.羧甲基殼聚糖的骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗［J］.毒理學(xué)雜志，2008，22(1) :70-71.