高產(chǎn)EPS 乳酸菌株的篩選及在農(nóng)家干酪中的應(yīng)用

劉麗波，孫 迪，谷春濤，趙 鋒，徐 漸，周元良

( 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的一類(lèi)水溶性糖類(lèi)化合物［1］。按其所在位置的不同分為莢膜多糖和粘液多糖［2］，也可以根據(jù)多糖的組成不同將其分為同型多糖(HoPSs)和異型多糖(HePSs)［3］。乳酸菌EPS 是一種天然的、具有諸多生理功能的生物高分子聚合物，能夠粘合在細(xì)胞的表面，可以作為細(xì)胞膜的保護(hù)屏障，同時(shí)也是生物膜的組成成分。然而，EPS 的產(chǎn)量很低，只有少數(shù)EPS 被開(kāi)發(fā)應(yīng)用［4］，如黃原膠、硬葡聚糖、凝膠多糖已作為食品添加劑應(yīng)用于食品行業(yè)中。另外，細(xì)菌纖維素作為化妝品乳化穩(wěn)定劑被應(yīng)用于非食品行業(yè)［5］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些乳酸菌菌株如德氏保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌釋放的HePSs，能夠提高干酪的保水性，同時(shí)能夠在不改變干酪結(jié)構(gòu)的前提下改善干酪的整體質(zhì)地［6］。Perry 等研究發(fā)現(xiàn)［7］，利用高產(chǎn)EPS 菌株能夠得到低脂的意大利白干酪，在降低終產(chǎn)品熱量的基礎(chǔ)上改善奶酪的質(zhì)地。不僅如此，添加產(chǎn)EPS菌株(如嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌屬的菌株)有助于改善低脂干酪的流變學(xué)特性［8］。產(chǎn)EPS 的乳酸乳球菌乳脂亞種菌株可以在Cheddar 干酪成熟期間對(duì)干酪的質(zhì)地和微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有利的影響，從而改善Cheddar 干酪的功能特性［9］。但是目前還沒(méi)有研究將高產(chǎn)EPS 菌株應(yīng)用到農(nóng)家干酪中，確定其在不同條件下對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響。本研究首先從8 株嗜熱鏈球菌和8 株保加利亞乳桿菌中篩選出高產(chǎn)EPS 菌株，然后將其應(yīng)用到農(nóng)家干酪生產(chǎn)中，研究在不同的加工條件下，菌株對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響，對(duì)低脂干酪生產(chǎn)和質(zhì)量改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌8 株，編號(hào)為S0，MHQ，S7，S3.3，S3.6，S3.1，S3.7，S4、保加利亞乳桿菌8 株，編號(hào)為WK，JB，KD2，KD5，KD3，LTM，L2，L6均由乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))保藏;脫脂乳培養(yǎng)基、改良M17 培養(yǎng)基、改良MRS 培養(yǎng)基 各成分按照文獻(xiàn)進(jìn)行配制［10］;所用試劑為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析純化學(xué)試劑。

Beckman 25R 低溫冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼;冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用儀器廠;無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州醫(yī)用器械廠;TA.XT.Plus 物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro Systems 公司;DK-8K 恒溫水浴鍋 北京瑞利;DGF25012C 臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造;全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss 公司;干酪槽等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離與純化 在無(wú)菌條件下將上述16 株乳酸菌少許接入到12%(w/v)的脫脂乳中，37℃培養(yǎng)，待凝固且無(wú)乳清析出時(shí)取出放入4℃保存。將上述16 株菌繼續(xù)用12%(w/v)的脫脂乳傳代培養(yǎng)約3次，至凝乳時(shí)間5～6h 停止活化培養(yǎng)，記錄凝乳時(shí)間，放入4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將活化好? 株嗜熱鏈球菌接種到pH6.5 改良M17 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，8 株保加利亞乳桿菌接種到pH6.0 改良MRS 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，平板上長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，確定是否為純菌株，如有雜菌混入可進(jìn)一步純化。挑取鏡檢后的單一菌落接入液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)。

1.2.2 高產(chǎn)EPS 菌株的篩選 經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基活化后的16 株乳酸菌，分別按接種量3% 接入100mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h 后，10000×g 離心10min 除菌體，上清液濃縮至原體積的1/5后加入等體積的40%三氯乙酸沉淀并去除蛋白，得到的上清液中加入3 倍95%乙醇沉淀多糖，12h 后，在12000 ×g，30min 離心收集沉淀，溫水溶解沉淀，去離子水透析48h，透析液稱(chēng)量、定容、稀釋后，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖合成量。以乳酸菌EPS 的合成量作為菌株篩選的指標(biāo)。嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基采用pH6.5 改良M17 培養(yǎng)基，保加利亞乳桿菌采用pH6.0改良MRS 培養(yǎng)基。

1.2.3 苯酚—硫酸法測(cè)定多糖合成量 精密稱(chēng)取于105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1468g，置于250mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液3.0、5.0、7.0、9.0、11.0mL 分別置于50mL 容量瓶中以去離子水稀釋至刻度搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取上述標(biāo)液2.0mL，加苯酚1.0mL，然后迅速再加入5.0mL 濃硫酸，搖勻放置5min，后置100℃水浴15min 取出冷卻至室溫。于490nm 測(cè)定吸光度得回歸方程。另以去離子水加苯酚和濃硫酸試劑同上操作為空白對(duì)照。樣品經(jīng)分離得多糖后，于200mL 容量瓶定容，取樣品2mL 后，同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的操作，測(cè)定吸光度后查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得多糖濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即得上清液中多糖的合成量。

1.2.4 農(nóng)家干酪加工工藝 脫脂乳→標(biāo)準(zhǔn)化→均質(zhì)→殺菌→冷卻(30～32℃) →發(fā)酵劑→氯化鈣→凝乳酶→切割→攪拌→加熱→排乳清→水洗→瀝干→拌鹽(1%) →成品

實(shí)驗(yàn)添加4% 液態(tài)發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌L6∶嗜熱鏈球菌S7∶保加利亞乳桿菌LTM∶乳酸乳球菌=1∶1 ∶1 ∶1)，在前期研究中發(fā)現(xiàn)此比例合成較高EPS。發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵時(shí)間為1h。

1.2.5 添加高產(chǎn)EPS 菌株在不同條件下對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響

1.2.5.1 稀奶油添加量對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響 分別配制1L 固形物含量為11%，脂肪含量分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的脫脂乳。實(shí)驗(yàn)中所用脫脂乳粉的脂肪含量為1.5g/100g，稀奶油的脂肪含量為35.5g/100g。通過(guò)計(jì)算稀奶油添加量為2.4%、3.8%、5.2%、6.7% 和8.1%，脫脂乳粉添加量為10.1%、9.6%、9.1%、8.5%和8.0%。通過(guò)對(duì)農(nóng)家干酪的含水量、蛋白質(zhì)含量和硬度的測(cè)定，確定最佳稀奶油添加量。

1.2.5.2 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響分別 用 63℃、30min;72℃、15min;85℃、15min;100℃、8min 和115℃、8min 的熱處理?xiàng)l件對(duì)原料乳進(jìn)行殺菌。通過(guò)對(duì)農(nóng)家干酪的含水量、蛋白質(zhì)含量和硬度的測(cè)定，確定熱處理的最適條件。

1.2.5.3 不同氯化鈣添加量對(duì)干酪品質(zhì)的影響 在農(nóng)家干酪的制作工藝中，分別加入0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%的氯化鈣，通過(guò)不同氯化鈣添加量對(duì)農(nóng)家干酪含水量、蛋白質(zhì)含量和硬度的影響，確定最適氯化鈣添加量。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

1.2.6.1 農(nóng)家干酪含水量的測(cè)定 取少量成品干酪，切碎后準(zhǔn)確稱(chēng)量5g 碎樣于平皿內(nèi)，置于干燥箱內(nèi)，溫度設(shè)置為100～105℃，烘干至恒重后，測(cè)量總質(zhì)量，通過(guò)質(zhì)量差計(jì)算出干酪的含水量。

1.2.6.2 農(nóng)家干酪蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 利用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［11］中凱氏定氮法測(cè)定農(nóng)家干酪的蛋白質(zhì)含量。

1.2.6.3 農(nóng)家干酪質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定 將一塊干酪的上下和邊緣5mm 的部分去掉，樣品室溫下放置30min。利用質(zhì)構(gòu)儀來(lái)測(cè)定干酪的硬度。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)如下:測(cè)定模式:力/張力;測(cè)試前速度:1.00mm/s;測(cè)試速度:1.00mm/s;測(cè)試后速度:1.00mm/s;下壓距離:30%;探頭型號(hào):P/0.5 DIA Cylinder Ebonite［12］。

1.2.6.4 農(nóng)家干酪的感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)定在食品工藝室內(nèi)完成，邀請(qǐng)10 名從事本專(zhuān)業(yè)方向的研究人員組成評(píng)定小組，從風(fēng)味、質(zhì)地、外觀等方面進(jìn)行感官評(píng)定和感官評(píng)分［13］，具體的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株EPS 合成量的測(cè)定

2.1.1 苯酚—硫酸法測(cè)定EPS 合成量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)苯酚—硫酸法測(cè)定多糖合成量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如下，回歸方程為:y =6.2061x-0.0018，R2=0.9991。

2.1.2 嗜熱鏈球菌EPS 合成量的測(cè)定 8 株球菌分別在100mL 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度37℃，球菌初始pH 為6.5，不同菌株多糖合成量，以mg/L表示。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation index

圖1 胞外多糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of determining EPS

從表2 可以看出S3.3，S3.6，MHQ，S7的4 株球菌多糖合成量較高，適合于進(jìn)一步優(yōu)化進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。

表2 嗜熱鏈球菌多糖合成量Table 2 The EPS production by S.thermophilus

表3 嗜熱鏈球菌優(yōu)選菌株驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of test for S.thermophilus

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明嗜熱鏈球菌S7是在8 株嗜熱鏈球菌中EPS 合成量最高的菌株，合成量可達(dá)56.25mg/L，適合作為高產(chǎn)EPS 菌株繼續(xù)進(jìn)行農(nóng)家干酪的研究。

2.1.3 保加利亞乳桿菌EPS 合成量的測(cè)定 受試的保加利亞乳桿菌共8 株，分別命名為WK，JB，KD2，KD5，KD3，LTM，L2，L6，將8 株保加利亞乳桿菌接入100mL 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度37℃，初始pH 均為6.0，測(cè)得不同菌株多糖合成量，以mg/L 表示。

從表4 可以看出，保加利亞乳桿菌WK，JB，KD2，KD5，KD3多糖合成量不高，而保加利亞乳桿菌L2，L6，LTM 多糖的合成量都較高且相差結(jié)果不大，需通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定最適菌株，結(jié)果如表5。

表4 保加利亞乳桿菌多糖合成量Table 4 The EPS production by L.bulgaricus

表5 保加利亞乳桿菌優(yōu)選菌株驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of test for L.bulgaricus

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也表明菌株L6多糖合成量最高，合成量可達(dá)到51.53mg/L，L2和LTM 合成量也達(dá)到50mg/L，但LTM 合成量較高，接近于L6菌株EPS 合成量，所以菌株L6和LTM 適合作為高產(chǎn)EPS 菌株繼續(xù)進(jìn)行農(nóng)家干酪的研究。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在同樣的培養(yǎng)條件下，嗜熱鏈球菌S7和保加利亞乳桿菌L6、LTM 在MRS 液體培養(yǎng)基中的EPS 合成量較高，將用于進(jìn)一步農(nóng)家干酪的研究。

2.2 不同稀奶油添加量對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響

不同稀奶油添加量對(duì)農(nóng)家干酪的含水量、蛋白質(zhì)含量和硬度的影響如圖2。從圖中可以看出，對(duì)于干酪水分的影響，隨著稀奶油添加量的增大，干酪的水分含量明顯增加，當(dāng)脂肪含量達(dá)到2.5%時(shí)，干酪含水量達(dá)到峰值67.1%，但過(guò)多的稀奶油反而會(huì)使干酪含水量降低;而相對(duì)于干酪蛋白質(zhì)含量來(lái)說(shuō)，隨著稀奶油添加量的增大，干酪中蛋白質(zhì)的含量逐漸減少，脂肪含量為1% 時(shí)，干酪蛋白含量最多為17.00%，脂肪含量為3%時(shí)，干酪的蛋白含量最少為12.05%;同時(shí)，隨著稀奶油添加量的增大，干酪的硬度逐漸降低，脂肪含量從1%提升到2%時(shí)，下降趨勢(shì)明顯，而脂肪含量從2.5%到3%時(shí)，下降趨勢(shì)緩和。

圖2 不同稀奶油添加條件對(duì)干酪品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different content of cream on quality of cheese

2.3 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響

不同熱處理?xiàng)l件對(duì)農(nóng)家干酪的含水量、蛋白質(zhì)含量和硬度的影響如圖3。結(jié)果表明，隨著熱處理強(qiáng)度的加大，干酪含水量逐漸增加，當(dāng)熱處理?xiàng)l件為115℃8min 時(shí)，干酪含水量達(dá)到峰值65.7%，但是過(guò)高的熱處理溫度對(duì)蛋白質(zhì)的影響就會(huì)比較大;從熱處理?xiàng)l件對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響就可以看出，當(dāng)熱處理?xiàng)l件逐漸加強(qiáng)時(shí)，干酪的蛋白質(zhì)含量逐漸增加，熱處理?xiàng)l件為100℃8min 時(shí)最高，達(dá)到17.2%，但當(dāng)熱處理?xiàng)l件為115℃8min 時(shí)，干酪中蛋白質(zhì)含量反而降低;從干酪的硬度結(jié)果可以看出，隨著熱處理?xiàng)l件的加大，干酪的硬度呈降低趨勢(shì)，當(dāng)熱處理?xiàng)l件為85℃15min 時(shí)硬度最低，100℃8min 時(shí)稍有提高，當(dāng)強(qiáng)度進(jìn)一步增大時(shí)，硬度又再次降低。

2.4 不同氯化鈣添加量對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)的影響

圖3 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)干酪品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different heat treatment conditions on quality of cheese

由圖4 可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著氯化鈣添加量的增大，農(nóng)家干酪的含水量逐漸降低。當(dāng)氯化鈣的添加量從0.01%增加至0.03%時(shí)，產(chǎn)品含水量大幅下降，而后則趨于平穩(wěn)。同時(shí)，隨著氯化鈣添加量的增大，農(nóng)家干酪的蛋白質(zhì)含量逐漸降低。其中，氯化鈣添加量為0.01%時(shí)產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量最高。對(duì)于干酪的硬度來(lái)說(shuō)，隨著氯化鈣添加量的增大，農(nóng)家干酪的硬度先增大后減小，在添加量為0.05%時(shí)硬度達(dá)到最大值，而添加量為0.01%時(shí)為最小值。這是由于Ca2+能夠影響凝乳酶的反應(yīng)速度，適量添加氯化鈣能夠加速凝乳過(guò)程，提高干酪的硬度和彈性。Ca2+濃度較低時(shí)，凝乳速度慢，形成的凝塊含水量高，質(zhì)地也較軟;隨著氯化鈣添加量的增大，產(chǎn)品硬度會(huì)相應(yīng)提高，超出一定范圍后，則會(huì)對(duì)干酪的感官狀態(tài)與品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。

2.5 感官評(píng)價(jià)

通過(guò)感官評(píng)價(jià)，可以得出的結(jié)論是，隨著稀奶油添加量的增大，干酪的風(fēng)味明顯呈上升趨勢(shì)。當(dāng)稀奶油添加量為5.2%時(shí)，農(nóng)家干酪感官評(píng)分最高，而當(dāng)添加量繼續(xù)增加時(shí)，干酪的風(fēng)味略有降低，在添加量為8.1%時(shí)，干酪的感官評(píng)價(jià)相對(duì)較差。另外，隨著熱處理強(qiáng)度的加大，干酪的質(zhì)地逐漸變?nèi)彳洠捕戎饾u下降，當(dāng)熱處理?xiàng)l件為72℃15min 時(shí)，干酪的感官評(píng)價(jià)最高，隨著熱處理強(qiáng)度的進(jìn)一步加大，干酪的質(zhì)地會(huì)過(guò)于疏松，易碎。不僅如此，隨著熱處理強(qiáng)度增加，干酪的光澤度也逐漸增加。對(duì)于氯化鈣的添加量來(lái)說(shuō)，當(dāng)添加量為0.01%時(shí)，干酪的各項(xiàng)評(píng)分最高。隨著添加量的不斷增加，干酪的硬度也隨之增加，使農(nóng)家干酪的質(zhì)地堅(jiān)硬，風(fēng)味變差，但色澤變化不明顯。

圖4 不同氯化鈣添加量對(duì)干酪品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different amount of CaCl2 on quality of cheese

表6 不同因素對(duì)干酪感官評(píng)價(jià)的影響Table 6 Effect of different factors on sensory evaluation of cheese

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，同樣的培養(yǎng)條件下，嗜熱鏈球菌S7和保加利亞乳桿菌L6、LTM 在MRS 液體培養(yǎng)基中的EPS 合成量較高，適合進(jìn)一步用于農(nóng)家干酪的研究。本實(shí)驗(yàn)中不同稀奶油添加量、熱處理?xiàng)l件和氯化鈣添加量對(duì)農(nóng)家干酪品質(zhì)影響的研究結(jié)果表明，以感官評(píng)定值為主指標(biāo)，結(jié)合含水量、蛋白質(zhì)含量和硬度指標(biāo)，確定當(dāng)稀奶油添加量為5.2%、熱處理?xiàng)l件為72℃15min、氯化鈣添加量為0.01%時(shí)，用高產(chǎn)EPS菌株生產(chǎn)所得的農(nóng)家干酪品質(zhì)最佳，符合國(guó)家農(nóng)業(yè)部軟質(zhì)干酪的標(biāo)準(zhǔn)，可應(yīng)用于農(nóng)家干酪的生產(chǎn)。

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