響應(yīng)面法優(yōu)化香櫞果膠提取工藝

牛麗影，李大婧，劉春泉，*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014;2.國(guó)家農(nóng)業(yè)科技華東(江蘇)創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014)

香櫞(Citrus wilsonii Tanaka)為柑橘屬植物，樹(shù)形優(yōu)美，果實(shí)氣味芳香清靈［1］。香櫞在中國(guó)已有兩千余年的栽培歷史，是一種藥食同源的經(jīng)濟(jì)作物，其干燥果實(shí)為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，可用于多種復(fù)方制劑。國(guó)內(nèi)外關(guān)于香櫞的研究較少，僅有少量植物學(xué)分類［2］、中藥學(xué)鑒定［3-4］、栽培繁育［5］的報(bào)道，而國(guó)外僅有其近緣種枸櫞(Citrus medica L.)精油成分及生物活性［6］的報(bào)道。目前，香櫞在我國(guó)作為園林觀賞植物廣為栽培，尤其在江蘇省靖江市，香櫞作為市樹(shù)，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；N植，2012 年果實(shí)產(chǎn)量達(dá)到3000t 左右，為實(shí)現(xiàn)資源的充分利用，當(dāng)?shù)匮兄频南銠达嬃弦蚱淝逅巳说目诟屑跋銡馐艿綇V大消費(fèi)者的歡迎［7］。但是加工飲料后，大量果皮果渣的利用成為迫切需要解決的問(wèn)題。從柑橘類果皮果渣中提取果膠一直是重要的果膠來(lái)源，果膠作為一種天然線性高分子化合物，具有良好的凝膠性和乳化穩(wěn)定性，并具有抗腹瀉、抗癌、減肥和治療糖尿病等作用，可廣泛用于食品、醫(yī)藥、日化產(chǎn)品中［8-9］。果膠提取的方法有多種，目前商業(yè)上多采用在加熱條件下，利用稀酸使細(xì)胞壁中的果膠釋放，再用乙醇沉淀收集果膠［10-11］。在提取工藝優(yōu)化方法中，響應(yīng)面法能夠在小區(qū)域內(nèi)用簡(jiǎn)單的一次或二次多項(xiàng)式模型來(lái)擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，從而得到準(zhǔn)確有效的結(jié)論［12］。因此，為確定香櫞果膠提取參數(shù)的優(yōu)化，本研究采用響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，系統(tǒng)研究了影響果膠得率的主要因素及其相互關(guān)系，并采用響應(yīng)面法擬合得到回歸方程，優(yōu)選出優(yōu)化工藝條件，為工業(yè)生產(chǎn)開(kāi)發(fā)提供有價(jià)值的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香櫞鮮果 江蘇省靖江市，手工分離的香櫞果皮在60℃烘箱烘干，研磨機(jī)磨粉，過(guò)20 目篩，備用;無(wú)水乙醇 南京化學(xué)試劑有限公司。

HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司;TDL-5-A 型大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;PHS-5 型pH 計(jì) 上?？祪x儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法 稱取香櫞果皮粉1.0g 于50mL 離心管內(nèi)，按照設(shè)定料液比加入蒸餾水，用6mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至設(shè)定值，置于設(shè)定溫度水浴，至設(shè)定時(shí)間取出離心，取上清液按照體積比1∶1 加入無(wú)水乙醇，離心得到沉淀出的果膠。將醇沉得到的果膠加入無(wú)水乙醇20mL，攪拌再離心除去醇溶性雜質(zhì)，用無(wú)水乙醇洗滌至離心后的上清液穆立虛反應(yīng)［13］為陰性，然后將得到果膠在250mL 容量瓶用水定容，參照龐榮麗等的方法［14］，利用硫酸-咔唑比色法計(jì)算果膠含量。上述過(guò)程中離心條件均為5000 ×g，15min。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 首先在pH 為1.8，85℃提取2.5h 條件下，研究不同液固比(15mL/g、20mL/g、25mL/g、30mL/g)對(duì)得率的影響，其次在優(yōu)選的液固比及85℃提取2.5h 條件下，分析不同pH(0.8、1.8、2.3、2.8、3.0)對(duì)果膠得率的影響，最后在優(yōu)選的液固比和pH 下，分別在65、75、85、95℃溫度下進(jìn)行水浴，管內(nèi)溫度達(dá)到各設(shè)定溫度后開(kāi)始計(jì)時(shí)，計(jì)時(shí)滿0.5h 后每間隔0.5h 取出離心管，自來(lái)水沖涼至室溫，至計(jì)時(shí)3.0h，即各溫度下均有六個(gè)不同酸解時(shí)間的樣品，得到各溫度下果膠得率隨時(shí)間變化的曲線。以上實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理均進(jìn)行三次重復(fù)。

1.2.3 果膠得率計(jì)算方法 以萃取得到的果膠得率作為度量標(biāo)準(zhǔn)，公式為:

式中:x1-果膠質(zhì)量，g;m-果皮粉質(zhì)量，g。

1.2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)料液比、萃取pH、萃取溫度(℃)、萃取時(shí)間(h)四個(gè)影響萃取率的主要因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。Box-Behnken 設(shè)計(jì)的四因素三水平編碼表如表1 所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，求得回歸方程。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Code and levels of factors design for experiment

1.3 數(shù)據(jù)分析

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用采用Origin Pro7.5(Origin Lab Corp.，Northampton，MA，USA)進(jìn)行單因素方差分析，p ＜0.05 為差異顯著。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析利用軟件Design expert 7.1(Stat-ease Inc.，MN，USA)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 液固比對(duì)果膠得率的影響

液固比對(duì)果膠得率的影響如圖1 所示。在液固比25mL/g 時(shí)，得率最高。在提取的過(guò)程中，物料粉末在水中的溶脹特性、以及酸解后果膠的粘度對(duì)液固分離的影響直接影響果膠的得率，并體現(xiàn)為液固比的作用。液固比太低，液固分離過(guò)程造成的損失加大，但過(guò)高液固比也未能增加果膠的得率，反而會(huì)增加醇沉工序中醇的用量，甚至有可能由于其他水溶或酸溶性成分進(jìn)入提取液中相對(duì)濃度的增加而導(dǎo)致果膠提取得率的降低。鑒于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇25mL/g 進(jìn)行后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)。

圖1 液固比對(duì)香櫞果皮果膠得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on yield of pectin

2.2 pH 對(duì)果膠得率的影響

如圖2 所示，在測(cè)定的pH 中，pH1.8 時(shí)的果膠得率最高。果皮中的果膠多以原果膠的形式存在，原果膠在稀酸溶液中水解為水溶性果膠，從而使果膠從果皮轉(zhuǎn)到水相。果膠的酸離解常數(shù)變化范圍為3.55～4.10［15］，D-半乳糖醛酸的酸離解常數(shù)為3.52。本實(shí)驗(yàn)在液固比25mL/g 的情況下，香櫞皮粉水溶液的初始pH 為3.26，因此選擇低于3.0 的pH 進(jìn)行研究。溶液pH 偏高，提取時(shí)間將會(huì)延長(zhǎng)，果膠的穩(wěn)定性下降，容易分解成果膠酸，使產(chǎn)率下降。而pH 過(guò)低，提取時(shí)間縮短，造成果膠進(jìn)一步分解，導(dǎo)致果膠損失，使產(chǎn)品得率降低，同時(shí)也使果膠色澤加深［16］。pH2.0 左右作為果膠提取的最佳pH 在其他柑橘類果膠提取中也多有報(bào)道［17-18］，因此選擇在pH1.8 條件下，考察溫度與時(shí)間因素對(duì)得率的影響。

圖2 pH 對(duì)果膠得率的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of pectin

2.3 萃取溫度和時(shí)間對(duì)果膠得率的影響

由圖3 可知，在不同溫度下，果膠的得率出現(xiàn)了不同的變化趨勢(shì)。在較高溫度95、85 和75℃下，最高值分別出現(xiàn)在0.5、1.5 和2.0h，隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，果膠得率下降。而在較為溫和的65℃條件下，果膠得率整體偏低，最高值出現(xiàn)在1.5h。較高溫度下萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能使果膠發(fā)生β-鍵消除作用而解聚，從而影響果膠的產(chǎn)量［19-20］。

圖3 溫度對(duì)果膠得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of pectin

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件及結(jié)果表Table 2 Design and results of response surface experiment

對(duì)表2 在不同條件下所獲得的果膠得率，利用design expert 7.1 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行二項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸方程:

由表3 對(duì)方程進(jìn)行F 檢驗(yàn)可得出，失擬檢驗(yàn)得到p =0.0870，檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明其它因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小;擬合模型的p ＜0.0001，檢驗(yàn)極顯著，說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合良好，能夠反映果膠得率與液固比、萃取pH、萃取溫度、萃取時(shí)間之間的關(guān)系，同時(shí)復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9881，可以利用此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)中果膠率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis results of regression equation

回歸系數(shù)取值及方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Test of significance for regression coefficient

由表4 顯著性檢驗(yàn)可知，x1、x2、x3、x1x3、x3x4、x12、x22、x32、x42項(xiàng)對(duì)得率有顯著影響，設(shè)定的四個(gè)因素中液固比、pH、溫度對(duì)得率的影響均達(dá)極顯著水平，雖然時(shí)間對(duì)得率影響不顯著，但是時(shí)間與溫度的交互作用達(dá)到顯著水平。通過(guò)對(duì)回歸方程進(jìn)行中心標(biāo)準(zhǔn)化處理，從回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小來(lái)分析各個(gè)因素的改變對(duì)萃取率影響的大小?；貧w方程一次項(xiàng)的回歸系數(shù)絕對(duì)值大小依次為x2＞x3＞x1＞x4，表明pH 對(duì)果膠得率的影響最大，其次萃取溫度、液固比和萃取時(shí)間。

2.3 果膠得率響應(yīng)面分析

將二項(xiàng)式方程中的液料比、pH、提取溫度和提取時(shí)間分別固定在零水平，做出交互效應(yīng)響應(yīng)面圖，根據(jù)曲面變化可對(duì)各因素的作用特點(diǎn)獲得直觀的解釋［21］。如圖4 所示，在pH 與液固比、時(shí)間及溫度的響應(yīng)曲面中可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)其他兩個(gè)因素維持不變時(shí)，果膠得率均表現(xiàn)出隨pH 升高先升高后下降的趨勢(shì)，在pH2.0 左右出現(xiàn)最大值。在時(shí)間與pH 的響應(yīng)曲面中，曲面隨時(shí)間變化相對(duì)平滑，說(shuō)明果膠得率對(duì)pH 變化比對(duì)時(shí)間變化更為敏感。當(dāng)pH 與時(shí)間維持不變時(shí)，隨溫度升高，料液比對(duì)果膠得率的影響減小;同樣pH 與液固比維持不變時(shí)，隨溫度升高，時(shí)間對(duì)果膠得率的影響減小，說(shuō)明溫度與液固比、溫度與時(shí)間因素間存在顯著的交互作用，這可能是由于較低液固比時(shí)果膠溶液的粘度較大，影響了分離效果，而較高溫度減弱了液固比造成的影響;另一方面在較高溫度下果膠的水解速度加快，也構(gòu)成了溫度與時(shí)間顯著的交互作用。

圖4 各因素對(duì)果膠得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface and contour plot of the factors

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及最佳萃取條件的確定

根據(jù)模型，利用Design expert 7.1 軟件計(jì)算得到最優(yōu)工藝方案:液固比26.29mL/g，pH1.95，反應(yīng)溫度82.11℃，反應(yīng)時(shí)間1.85h，得率為15.41%。為方便實(shí)際操作，將優(yōu)化參數(shù)調(diào)整為液固比25mL/g，pH2.0，反應(yīng)溫度85.0℃，反應(yīng)時(shí)間1.75h，在此優(yōu)化條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，實(shí)際測(cè)得的平均得率為15.37%～15.68%，平均值為15.52%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其誤差低于1.0%，說(shuō)明基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本研究以果膠得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析方法中的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到料液比、萃取溫度(℃)、萃取pH、萃取時(shí)間(h)四個(gè)因素的二項(xiàng)式回歸模型，經(jīng)過(guò)方差分析顯示該模型較好地反映了各因素果膠得率的影響，并得到最適工藝條件為液固比25mL/g，pH2.0，反應(yīng)溫度85.0℃，反應(yīng)時(shí)間1.75h，此條件下果膠的得率為15.52%。

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