槲皮素對(duì)高脂日糧小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響研究

鄭 靜，田英杰，陳立立，樂(lè)國(guó)偉，2，施用暉，2

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全研究所，江蘇無(wú)錫214122;2.江南大學(xué)食品安全與科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

氧化應(yīng)激(Oxidative stress，OS)即體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與抗氧化防御體系之間失衡，從而導(dǎo)致組織損傷的一種狀態(tài)。氧自由基(ROS)生成增加，損害正常細(xì)胞，誘發(fā)各種人類疾病，其中就包括神經(jīng)退行性病變［1］，如帕金森，阿爾茲海默病，臨床上共同表現(xiàn)為記憶認(rèn)知能力的下降。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 屬于CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活家族，可以誘導(dǎo)抗氧化物質(zhì)和細(xì)胞保護(hù)成分的基因表達(dá)。研究表明［2］長(zhǎng)期高脂飼喂小鼠腦部氧化應(yīng)激增加，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 水平和活性下降，從而引起記憶能力衰退。血紅素單加氧酶1(HO-1)亦稱熱休克蛋白，能在氧化應(yīng)激或其他不利的刺激下迅速作出保護(hù)性應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑正二氫愈創(chuàng)酸(NDGA)可以通過(guò)激活抗氧化通路Nrf2/HO-1，減輕氧化應(yīng)激對(duì)小腦神經(jīng)元的損害［3］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain - derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一員，對(duì)神經(jīng)元的分化、存活起著重要的作用，在海馬、下丘腦、大腦皮層中表達(dá)尤為豐富［4］，與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)HO-1 可以通過(guò)其下游產(chǎn)物膽紅素和一氧化碳(CO)調(diào)控神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中BDNF 和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的表達(dá)［5］。以上研究說(shuō)明Nrf2/HO-1 是細(xì)胞抗氧化的重要通路，同時(shí)在維持大腦的正常功能中起重要作用。槲皮素(Quercetin，Q)及其衍生物是最常見(jiàn)的黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果及植物中，具有良好的抗氧化及保護(hù)神經(jīng)元，抗焦慮，增強(qiáng)認(rèn)知能力的作用。Heo 發(fā)現(xiàn)槲皮素可以保護(hù)中樞神經(jīng)細(xì)胞，減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，從而保護(hù)大腦的正常生理功能。本實(shí)驗(yàn)以長(zhǎng)期高脂日糧飼喂誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型，通過(guò)Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及基因的表達(dá)，探討槲皮素對(duì)高脂膳食小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)4 周齡C57B/L 雌性小鼠 上海斯萊克動(dòng)物中心;槲皮素 Sigma 公司，純度為99.5%;總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;3-硝基酪氨酸(3-NT)、4-羥基壬烯酸(4-HNE)測(cè)定試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司;AccuPower TM Greenstar qPCR PreMix 試劑盒 上海BIONEER 公司。

Morris 水迷宮 北京碩林苑科技有限公司;F96熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;熒光定量PCR 儀 美國(guó)AB 公司。

1.2 動(dòng)物分組和飼喂

選用C57B/L 雌性健康小鼠4 周45 只，1 周預(yù)飼后，根據(jù)體重隨機(jī)均分為3 組:正常對(duì)照組(Control，正常日糧)，高脂模型組(HFD，約20%脂肪)，槲皮素組(HFD +Q，高脂日糧添加0.01%槲皮素)(日糧配方見(jiàn)表1)。實(shí)驗(yàn)用小鼠同室分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由采食，充足飲水，室內(nèi)溫度(20 ± 2)℃，相對(duì)濕度55%。

1.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

26 周進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)程序包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。其中定位航行實(shí)驗(yàn)(Place navigation)即每天將小鼠面向池壁從特定的入水點(diǎn)放入水中，每次找到水面下的平臺(tái)后任其在平臺(tái)上停留20s，然后拿出小鼠擦干，休息30s后從下一個(gè)入水點(diǎn)再次放入水中，每只小鼠每天都從4 個(gè)特定的入水點(diǎn)被放入水中，共持續(xù)4d，記錄每一次小鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency);第5d 空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe)是在定位航行實(shí)驗(yàn)后去除平臺(tái)，然后任選一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠放入水池中，記錄其在60s 內(nèi)的游泳軌跡，記錄并統(tǒng)計(jì)原平臺(tái)象限游泳時(shí)間與總時(shí)間之比以及游泳路程與總路程之比，考察小鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶。

表1 實(shí)驗(yàn)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Formula and nutrients content of the dietary

1.4 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以戊巴比妥鈉麻醉小鼠，摘眼球取血，在冰浴上開(kāi)顱，迅速分離雙側(cè)大腦皮層和海馬，用0.9%生理鹽水沖洗除去表面殘血，左側(cè)皮層和海馬按重量體積比1∶10 用0.9%的預(yù)冷生理鹽水制成勻漿液用于氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定，右側(cè)海馬加入裝有1mL Biozol 的DEPC 處理過(guò)的EP 管中，于-70℃保存，用于基因測(cè)定。利用張迺哲等學(xué)者的熒光法在430nm 波長(zhǎng)下測(cè)定還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)吸光度(OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中GSH 和GSSG 濃度，算出GSH/GSSG。按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶標(biāo)儀在520nm 波長(zhǎng)下測(cè)定T-AOC 吸光度(OD)值，以及在532nm 波長(zhǎng)下測(cè)定MDA 吸光度(OD)值，根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算出組織中T-AOC 和MDA 含量。ELISA 試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法，用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定皮層中3-NT和海馬中4-HNE 吸光度(OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3-NT 和4-HNE 含量。熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)海馬組織中Nrf2，HO-1 以及BDNF 的基因表達(dá)。

1.5 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按Biozol 提供的說(shuō)明書(shū)提取海馬組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)鑒定其質(zhì)量和濃度。取合格的RNA 樣品2μg，加入 OligdT 2μL，20mmol/mL dNTP2μL，用DEPC 水補(bǔ)足體系至10μL，70℃水浴5min 后，冰浴迅速冷卻;隨后加入:5 × RT Buffer5μL，40U/μL RNA 酶抑制劑0.25μL，200U/μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，DEPC 水9.25μL。37℃水浴1.5h，95℃水浴3min，得到的cDNA。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列Table 2 Sequences of primers in quantitative real-time PCR

表3 槲皮素對(duì)高脂日糧小鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(n=10，ˉx±SD)Table 3 The effect of quercetin on the results of Morris Water Maze experiment of mice fed high-fat diet(n=10，ˉx±SD)

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用BIONEER 公司的AccuPowerTM Greenstar qPCR PreMix 試劑盒，每孔加入cDNA 模板0.5μL，正負(fù)鏈引物(10mM)各0.4μL，qPCR PreMix 5μL，無(wú)菌雙蒸水3.7μL，反應(yīng)體系為10μL。擴(kuò)增條件:95℃，5min;95℃，20s;60℃，30s;72℃，20s;45 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸2min，以β-actin(100μmol/L)為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR 分析?；蛞锞缮虾＝萑鹕锕こ逃邢薰驹O(shè)計(jì)合成(引物序列見(jiàn)表2)。RT-PCR產(chǎn)物的特異性由溶解曲線評(píng)估?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算方法參照Kenneth and Thomas 創(chuàng)立的方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、相關(guān)性分析，并Duncan 多重比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±SD表示，顯著水平為p ＜0.05，極顯著水平為p ＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對(duì)高脂日糧小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

由表3 可知，前4d 的定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠逃避潛伏期(escape latency，EL)逐漸縮短并出現(xiàn)分化，至訓(xùn)練第3d，與正常組相比，高脂組小鼠EL 顯著延長(zhǎng)(p ＜0.05)，槲皮素干預(yù)后EL 下降，但無(wú)顯著性差異(p ＞0.05);第4d，高脂組小鼠EL 顯著延長(zhǎng)(p ＜0.05)，槲皮素組干預(yù)后EL 顯著縮短(p ＜0.05);在第5d 的空間搜索實(shí)驗(yàn)中，高脂組原平臺(tái)象限游泳時(shí)間比例和路程比例與正常組相比顯著降低(p ＜0.05)，添加槲皮素后兩項(xiàng)指標(biāo)皆顯著升高(p ＜0.05)。說(shuō)明飼喂到26 周時(shí)，高脂組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著性衰退，槲皮素可以顯著增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2 槲皮素對(duì)高脂日糧小鼠大腦皮層和海馬氧化還原狀態(tài)的影響

由表4 可知，高脂組小鼠皮層和海馬T-AOC 與正常組相比顯著降低(p ＜0.05)，給予槲皮素后顯著上升(p ＜0.05);皮層GSH/GSSG 水平顯著下降(p ＜0.05)，給予槲皮素后恢復(fù)至正常;高脂組小鼠皮層中3-NT、MDA 以及海馬中4-HNE、MDA 的含量顯著升高(p ＜0.05)，添加槲皮素后，可顯著降低皮層MDA和海馬MDA、4-HNE 含量(p ＜0.05)，并使3-NT 恢復(fù)至正常水平。

2.3 槲皮素對(duì)高脂日糧小鼠海馬組織中Nrf2、HO-1和BDNF 基因相對(duì)表達(dá)量的影響

圖1 槲皮素對(duì)高脂日糧小鼠海馬組織中BDNF，Nrf2 以及HO-1 基因表達(dá)的影響(n=10，ˉx±SD)Fig.1 The effect of quercetin on the expression of BDNF，Nrf2 and HO-1 in hippocampus of mice fed high-fat diet(n=10，ˉx±SD)

如圖1 所示，給予高脂膳食后，Nrf2、HO-1 和BDNF 的表達(dá)與正常組相比顯著下調(diào)(p ＜0.05)，槲皮素干預(yù)后，Nrf2、HO-1 和BDNF 的表達(dá)與高脂組相比顯著上調(diào)(p ＜0.05)，其中HO-1 表達(dá)恢復(fù)至正常水平。

表4 槲皮素對(duì)高脂日糧小鼠大腦皮層和海馬氧化還原狀態(tài)的影響(n=10，ˉx±SD)Table 4 The effect of quercetin on the redox state of cortex and hippocampus of mice fed high-fat diet(n=10，ˉx±SD)

3 結(jié)論

3.1 認(rèn)知能力下降伴隨著衰老而發(fā)生，表現(xiàn)為思維敏捷程度下降以及學(xué)習(xí)記憶能力下降。近年來(lái)已有不少研究發(fā)現(xiàn)高脂膳食能造成認(rèn)知障礙，但是迄今為止其具體機(jī)制仍不清楚。目前較為廣泛接受的是氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、胰島素抵抗學(xué)說(shuō)、tau 蛋白學(xué)說(shuō)等，其中氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)在神經(jīng)退行性病變過(guò)程中的作用越發(fā)受到關(guān)注。腦組織是體內(nèi)氧負(fù)荷最大的器官之一，雖然人腦的重量?jī)H占人體總重量2%～3%，但卻消耗了供應(yīng)機(jī)體的20%的氧。腦部有著高的糖代謝和呼吸代謝，高濃度的不飽和脂肪酸組成腦神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)，而且高濃度的反應(yīng)鐵離子和低濃度的抗氧化酶水平都使得腦組織更加容易受到ROS 的損傷［6］。Susan A［7］發(fā)現(xiàn)12 月齡的SAMP8 小鼠腦中氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量顯著高于4 月齡小鼠，學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，給予抗氧化劑α-硫辛酸和N-乙酰-半胱氨酸(NAC)后發(fā)現(xiàn)，大腦氧化應(yīng)激程度減輕，學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，說(shuō)明氧化應(yīng)激是學(xué)習(xí)記憶能力衰退的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Morris 水迷宮觀察到26 周高脂日糧小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織GSH/GSSG 和T-AOC水平顯著降低，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物3-NT 和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物4-HNE、MDA 含量顯著上升，槲皮素可以顯著改善高脂膳食引起的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，說(shuō)明長(zhǎng)期高脂飼喂導(dǎo)致小鼠腦部氧化平衡狀態(tài)被打破，引起了蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，而槲皮素可以顯著減輕腦部氧化應(yīng)激程度，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。

3.2 核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 能通過(guò)誘導(dǎo)一系列抗氧化劑保護(hù)蛋白的編碼，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的條件調(diào)節(jié)，因此成為細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的重要通路。Andy［8］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 的激活可以引發(fā)強(qiáng)烈的抗氧化應(yīng)答，尤其增加了GSH 的合成和利用;亦有研究發(fā)現(xiàn)蒜素可以通過(guò)增強(qiáng)Nrf2 抗氧化信號(hào)通路改善老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙［9］。血紅素氧合酶(HO-1)是體內(nèi)廣泛存在的一種抗氧化酶，HO-1 的誘導(dǎo)表達(dá)是通過(guò)激活Nrf2 在HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)中HO-1 表達(dá)可以上調(diào)多巴胺能神經(jīng)元中BDNF 和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的GDNF 表達(dá)水平;Yoshiko［10］等人發(fā)現(xiàn)4-愈創(chuàng)木酚(4-MC)可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞中HO-1 的表達(dá)，對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這一過(guò)程是依賴于PI3K/Akt 通路實(shí)現(xiàn)的。上述研究表明Nrf2/HO-1通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的抗氧化以及維持大腦正常功能的作用。本實(shí)驗(yàn)中，熒光定量PCR結(jié)果顯示，26 周后，高脂組小鼠海馬Nrf2 和HO-1 基因表達(dá)均出現(xiàn)顯著性下調(diào)，槲皮素干預(yù)后，Nrf2 表達(dá)水平顯著上調(diào)，HO-1 表達(dá)水平恢復(fù)至正常，說(shuō)明長(zhǎng)期高脂膳食抑制了Nrf2/HO-1 通路的正常表達(dá)，破壞了大腦正常的抗氧化防御能力，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，槲皮素顯著上調(diào)Nrf2/HO-1 基因表達(dá)，增強(qiáng)了腦部抗氧化能力，從而改善了學(xué)習(xí)記憶能力減退。

3.3 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)與其高親和力受體TrkB 在維持神經(jīng)元突觸活性和可塑性的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Aiguo［11］等人給予大鼠高脂膳食2 個(gè)月后發(fā)現(xiàn)BDNF、突觸蛋白1，CREB 等基因表達(dá)顯著性下調(diào)，記憶認(rèn)知能力衰退，給予抗氧化劑VE 治療后，腦部氧化應(yīng)激程度減輕，突觸蛋白1 和CREB 的激活過(guò)程正?；洃浾J(rèn)知能力得到恢復(fù)，說(shuō)明氧化應(yīng)激可以通過(guò)影響B(tài)DNF 體系來(lái)調(diào)控突觸可塑性和認(rèn)知能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組小鼠海馬BDNF表達(dá)水平顯著下調(diào)，給予槲皮素后，BDNF 表達(dá)水平顯著上調(diào)，所以我們推測(cè)長(zhǎng)期高脂膳食損害學(xué)習(xí)記憶能力可能是因?yàn)檎T導(dǎo)了腦部氧化應(yīng)激，削弱了神經(jīng)元突觸活性和可塑性。

3.4 槲皮素作為一種天然的黃酮類物質(zhì)廣泛存在于水果和蔬菜中，具有較強(qiáng)的抗氧化性和自由基清除能力。已有報(bào)道指出，槲皮素具有抗炎、抗凝血、抗缺血效應(yīng)［12］和神經(jīng)保護(hù)作用。Mubeen Ahmad Ansari［13］在海馬細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入β-淀粉樣蛋白(Aβ)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率下降，自由基水平上升，3-NT和4-HNE 含量升高，給予槲皮素預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性減弱，細(xì)胞存活率增加，自由基、3-NT和4-HNE 水平都下降，說(shuō)明適當(dāng)劑量的槲皮素可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用;亦有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元Nrf2 核轉(zhuǎn)位，增加谷胱甘肽水平來(lái)阻止H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起神經(jīng)元凋亡［14］;Shuang［15］發(fā)現(xiàn)槲皮素可以顯著減輕乙醇誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損害，并指出這一保護(hù)作用與激活ERK 和上調(diào)HO-1 基因表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予槲皮素治療后，小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力得到顯著增強(qiáng)，氧化應(yīng)激得到顯著改善，Nrf2/HO-1 通路和BDNF 基因表達(dá)顯著上調(diào)，所以我們推測(cè)槲皮素增強(qiáng)高脂日糧小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，可能與上調(diào)Nrf2/HO-1 抗氧化通路的基因表達(dá)，改善腦部氧化應(yīng)激，以及上調(diào)BDNF 基因表達(dá)有關(guān)。

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