液體發(fā)酵生產(chǎn)古尼蟲草多糖的營養(yǎng)條件優(yōu)化

劉曉翠，朱振元，孫會輕，李園園，代麗翠，張靜怡，呂 茜，高 輝

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

古尼蟲草[Cordyceps gunnii（Berk.）Berk.]是寄生于蝙蝠蛾幼蟲的一種較大型蟲草[1]，1983年我國首次報道了古尼蟲草[2]。實驗證明古尼蟲草與冬蟲夏草的95%乙醇浸液在紫外下光譜基本一致；蟲草與發(fā)酵所得的蟲草菌絲體具有相同的藥理作用[3-4]，并且古尼蟲草菌絲體含有較多的蟲草多糖，因此繼冬蟲夏草之后，古尼蟲草逐漸成為另一種重要的蟲草資源[5-10]。蟲草多糖是蟲草中重要的活性物質(zhì)，當前主要研究其提取純化方法、結(jié)構(gòu)、生物活性及作用機理[11-14]。李連德等[15]和許建明等[16]研究證明了古尼擬青霉小孢變種菌絲體胞內(nèi)多糖具有延緩果蠅成蟲的壽命作用，還可以減輕肝細胞壞死和肝臟炎癥。本實驗室在前期研究中，從古尼蟲草菌絲體中得到兩種分子量分別約為10ku和3700ku的單一成分多糖；體內(nèi)抗腫瘤活性研究表明，這兩種多糖均具有抗腫瘤作用，但大分子的蟲草多糖對腫瘤細胞的抑制率高于較小分子的蟲草多糖[17-20]。長期以來人們很重視通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高真菌菌絲生長，近年來國內(nèi)外的科技工作者開始初步涉及到發(fā)酵條件影響真菌多糖的形成。Chi-Hsein Chao等[21]研究了培養(yǎng)基的不同碳源和初始pH影響榆硬孔菌菌絲體多糖的理化性質(zhì)；Chin-Hang Shu等[22]研究了pH條件影響牛樟菇菌絲體發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量和分子量。有關(guān)古尼蟲草的深層發(fā)酵的研究已有很多[23-24]，但發(fā)酵條件對古尼蟲草多糖產(chǎn)量影響的研究還未見報道。因此，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，主要對液體發(fā)酵過程中影響古尼蟲草多糖產(chǎn)量的營養(yǎng)條件進行優(yōu)化，屬于對現(xiàn)代資源與功能生物的研究，這對多糖產(chǎn)量及其利用率的提高具有顯著的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

古尼蟲草菌（Cordyceps gunnii） 取自于天津科技大學生物資源與功能食品實驗室保藏菌種；斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基 蔗糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH均為自然，121℃滅菌20min；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖4%，蛋白胨1.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH均為自然，121℃滅菌20min（注：以上各樣品濃度均為質(zhì)量濃度）。

GHX-9160B-1型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器

上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；ESJ2054型電子分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；TGL-16B型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；HJ6型多頭磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；電熱鼓風干燥箱 余姚市遠東數(shù)控儀器廠；冷凍干燥機 美國Thermo。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 取保存于4℃冷藏冰箱中PDA斜面上的古尼蟲草菌種，采用PDA試管斜面培養(yǎng)法進行活化，培養(yǎng)完成后，作為液體發(fā)酵種子液的母種供后續(xù)實驗使用。

1.2.2 種子液的培養(yǎng) 按配方配制種子培養(yǎng)液滅菌晾涼后，無菌操作臺中用接種針挑取0.25cm2的古尼蟲草斜面菌種到液體種子培養(yǎng)基中。置于170r/min的恒溫搖床中25℃培養(yǎng)3d。實驗中所有三角瓶的裝液量均為100mL/250mL。

1.2.3 碳源單因素實驗

1.2.3.1 碳源種類對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別加入4%的葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作為三種不同的碳源，其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。

按8%的接種量接種古尼蟲草的種子液后，置于170r/min的恒溫搖床中25℃培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結(jié)束后采集菌絲體，凍干，對其菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量進行測量，并求平均值。

1.2.3.2 碳源初始濃度對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響根據(jù)1.2.3.1實驗結(jié)果，選擇其中最好的一種作為碳源，進行初始濃度的影響實驗。按照基本培養(yǎng)基的要求，配制成碳源質(zhì)量濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的培養(yǎng)基，其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。接種量、培養(yǎng)條件及對菌絲體的處理同1.2.3.1。

1.2.4 氮源單因素實驗

1.2.4.1 氮源種類對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別加入1.0%的牛肉膏、酵母膏和蛋白胨作為三種不同的氮源，其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。接種量、培養(yǎng)條件及對菌絲體的處理同1.2.3.1。

1.2.4.2 氮源初始濃度對古尼蟲草多糖產(chǎn)量的影響根據(jù)1.2.4.1的實驗結(jié)果，選擇則其中最好的一種作為氮源，進行初始濃度影響的實驗。按照基本培養(yǎng)基的要求，配制成氮源質(zhì)量濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的培養(yǎng)基，其他成分及含量不變。每組設(shè)置三個平行實驗。接種量、培養(yǎng)條件及對菌絲體的處理同1.2.3.1。

1.2.5 正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對影響古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的營養(yǎng)條件進行四因素三水平L9（34）正交實驗，各因素的實驗水平見表1。其中因素C、D是在本實驗室他人研究的基礎(chǔ)上確定的。

表1 正交設(shè)計因素水平表Table 1 Levels and factors table of orthogonal experiment

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體的處理 恒溫搖床培養(yǎng)后，觀察菌絲體生長量和形態(tài)。將三角瓶中菌絲體和培養(yǎng)基一起分裝到50mL的離心管中，6000r/min離心10min后棄上清液，收集沉淀（即發(fā)酵所得的古尼蟲草菌絲體）。為避免培養(yǎng)基中多糖等成分對糖含量或干重的影響，再對所得沉淀進行抽濾處理，在抽濾過程中用蒸餾水沖洗沉淀3～4次，將菌體上附著的液體培養(yǎng)基沖洗干凈。所得沉淀冷凍干燥。

菌絲體生物量是本實驗測量指標之一，因此對凍干后的菌絲體稱重。菌絲體生物量的計算公式[25]見式（1）：

式中，μ：菌絲體生物量（mg/100mL）；m1：100mL培養(yǎng)基產(chǎn)出的干菌絲質(zhì)量（mg）；V：培養(yǎng)液體積（100mL）。

1.2.7 古尼蟲草粗多糖的提取制備 取各配方所生產(chǎn)的蟲草菌絲粉，放入樣品瓶中，加入20倍的水，混勻，80℃沸水浴提取2h。布氏漏斗抽濾，取濾液，濾渣重復提取2次，合并濾液，濃縮后加4倍體積的95%乙醇4℃沉淀過夜；4000r/min離心8min后，收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥得粗多糖。

采用苯酚-硫酸法測定粗多糖樣品中總糖的含量，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定樣品中還原糖含量。多糖產(chǎn)量計算公式[26]見式（2）。

式中，μ′：多糖產(chǎn)量（mg/100mL）；m2：100mL培養(yǎng)基產(chǎn)出的總粗多糖質(zhì)量（mg）；m3：100mL培養(yǎng)基產(chǎn)出的還原糖質(zhì)量（mg）；V′：培養(yǎng)液體積（100mL）。

1.2.8 多糖回收率實驗 選擇無水葡萄糖作為碳源，采用同一培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物，1、2兩組均稱取0.3g的古尼蟲草菌絲體粉末，2組樣品作為實驗組在定容時加入烘干至恒重的葡萄糖粉末31.0mg。用苯酚-硫酸法分別測量多糖含量后計算回收率，其公式[27]見式（3）。

式中，P為樣品加標回收率；m1為未加標試樣測定質(zhì)量（mg）；m2為加標試樣測定質(zhì)量（mg）；m0為加標質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響

在微生物培養(yǎng)基中，最常用的碳源是葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，其對古尼蟲草菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量影響的實驗結(jié)果如表2所示，當碳源為可溶性淀粉時，菌絲體生物量相對較高，但是在培養(yǎng)基配制過程中發(fā)現(xiàn)，淀粉溶于培養(yǎng)基之后，培養(yǎng)基呈渾濁狀態(tài)，且在搖床培養(yǎng)期間，三角瓶底部有一層白色沉淀，最后在對發(fā)酵液進行離心和抽濾處理時，也不能完全保證將沉淀洗凈，結(jié)果所得胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最低；當碳源為蔗糖時，菌絲體生物量相對較高，且胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達到184.08mg/100mL，因此選擇蔗糖作為碳源繼續(xù)進行碳源濃度實驗。

表2 碳源種類對古尼蟲草菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of Carbon source types on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii

2.2 蔗糖濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響

不同蔗糖濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量影響的實驗結(jié)果見表3，當蔗糖質(zhì)量濃度為4%時，菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均達到最高，分別為1732.0、147.40mg/100mL，因此選擇蔗糖濃度為4%作為碳源濃度。

碳源單因素優(yōu)化實驗結(jié)果為：碳源種類為蔗糖，質(zhì)量濃度為4%。

表3 蔗糖濃度對古尼蟲草菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of sucrose concentration on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii

2.3 氮源種類對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響

本實驗室前期研究中，采用了NaNO3和（NH4）2SO4作為氮源培養(yǎng)古尼蟲草，其產(chǎn)出的菌絲體生物量分別為：755.2、707.6mg/100mL，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量分別為43.3、50.7mg/100mL，產(chǎn)量都不高，且為了與碳源種類數(shù)統(tǒng)一，本實驗選擇了三種常用有機氮源來進行氮源種類的篩選。實驗結(jié)果如表4所示，當?shù)鞍纂俗鳛榈磿r，菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量最高，分別為1357.7、98.87mg/100mL，因此選擇蛋白胨作為氮源繼續(xù)進行氮源濃度實驗。

表4 氮源種類對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of nitrogen source types on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii

2.4 蛋白胨濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響

不同蛋白胨濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量影響的實驗結(jié)果如表5所示，當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為1.0%時，菌絲體生物量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均達到最高，分別為869.4、102.49mg/100mL，因此選擇蛋白胨濃度1.0%作為氮源濃度。

氮源單因素優(yōu)化實驗結(jié)果為：氮源種類為蛋白胨，質(zhì)量濃度為1.0%。

表5 蛋白胨濃度對菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量的影響Table 5 Effect of peptone concentration on mycelium biomass and polysaccharide production of Cordyceps gunnii

2.5 正交實驗結(jié)果

以多糖產(chǎn)量為指標，進行4因素3水平正交實驗，結(jié)果如表6所示。由極差R值大小可知，各因素作用主次為A＞C＞B＞D，表明蔗糖濃度對胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響最大。根據(jù)K值比較，以A3B2C1D2組合為胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的最佳工藝條件，即蔗糖4%，蛋白胨1.0%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.1%。方差分析如表7所示，蔗糖濃度對胞內(nèi)多糖產(chǎn)量有顯著性的影響，因此在發(fā)酵條件優(yōu)化時要首先予以考慮。

表6 正交實驗結(jié)果Table 6 The results of orthogonal experiment

表7 方差分析表Table 7 Variance analysis of orthogonal test

2.6 實驗驗證

為了確定最佳組合的效果，進行了驗證實驗，將正交實驗得到的最佳工藝組合A3B2C1D2與優(yōu)化前基礎(chǔ)培養(yǎng)基（蔗糖4%，蛋白胨1.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.1%）在相同條件下培養(yǎng)，比較胞內(nèi)粗多糖產(chǎn)量的大小。設(shè)置三個平行實驗，熱水浸提多糖，重復三次，苯酚硫酸比色法測定多糖含量，計算胞內(nèi)多糖產(chǎn)量，結(jié)果如表8所示：

表8 驗證實驗結(jié)果Table 8 Validation test results of orthogonal design

從表8可以看出，當培養(yǎng)基配方為優(yōu)化培養(yǎng)基A3B2C1D2組合時，古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為（181.5±2.3）mg/100mL，而當培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為（141.4±2.4）mg/100mL，可得出，優(yōu)化后的培養(yǎng)基的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量提高了28.36%，優(yōu)化作用顯著（p＜0.05）。故最佳工藝條件為：蔗糖4%，蛋白胨1.0%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.1%。

2.7 回收率測定

回收率實驗結(jié)果見表9?；厥章剩?9.39%。證明本實驗所用方法的系統(tǒng)誤差較小，適合本研究。由于菌絲體培養(yǎng)周期較長，本實驗只進行了一次回收率測定，理論上最少重復三次實驗。

表9 回收率實驗結(jié)果Table 9 The results of recovery test

3 結(jié)論

本文通過單因素實驗和正交實驗，確定液體發(fā)酵古尼蟲草多糖的最佳工藝條件為蔗糖4%，蛋白胨1.0%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.1%。在此條件下，古尼蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為（181.5±2.3）mg/100mL。庶糖濃度對發(fā)酵結(jié)果具有顯著性影響，在對發(fā)酵條件進行優(yōu)化時應(yīng)首先予以考慮?；厥章蕿?9.39%，證明本實驗所用方法的系統(tǒng)誤差較小，適合本研究。

此外，本研究中，在最佳單因素實驗條件下，古尼蟲草菌絲體生物量為869.4mg/100mL，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為102.49mg/100mL，即多糖含量為117.89mg/g菌絲體，與孟祥賢[28]研究結(jié)果中多糖含量28.2mg/g及傅嵐研究結(jié)果中多糖含量41.92mg/g相比較，已有了很大程度的提高，可為大量獲得古尼蟲草多糖提供理論和技術(shù)指導。

通過對菌絲體生物量與多糖產(chǎn)量的對比發(fā)現(xiàn)，兩者沒有相關(guān)性（除氮源種類組外），因此古尼蟲草菌絲體內(nèi)除了多糖外，還含有其他活性物質(zhì)。

本課題存在需進一步解決的問題，如對液體發(fā)酵古尼蟲草多糖過程中環(huán)境條件的優(yōu)化，有待于進一步研究。

[1] 劉愛英，梁宗琦，曹蕾. 古尼蟲草人工培養(yǎng)物的營養(yǎng)成分含量分析[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，1991，8（2）：5-8.

[2] 梁宗琦. 一種國內(nèi)未見報道的蟲草菌--古尼蟲草[J]. 菌物學報，1983，3（4）：258-260.

[3] 張永明，張倩，梁宗琦. 古尼蟲草的研究現(xiàn)狀與發(fā)展動態(tài)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2006，34（2）：121-123.

[4] 王尊生，俞永信，袁勤生. 蟲草屬真菌的生物活性成分[J].中草藥，2004，35（10）：8-11.

[5] 肖建輝，方寧，肖瑜，等. 古尼擬青霉胞外多糖的免疫抑制活性[J]. 中藥材，2004，27（3）：192-195.

[6] 肖建輝，梁宗琦，胡錫階，等. 古尼蟲草多糖及其解聚物的免疫活性[J]. 免疫學雜志，2005，21（1）：51-54.

[7] 梅德強，文庭池，梁宗琦. 古尼擬青霉菌絲體多糖（MPPG）對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫抑制因子的影響[J].貴州大學學報，2006，23（2）：191-195.

[8] Blobe G C，Sch Iemann W P，Lod Ish H F. Role of transforming growth factor in human disease[J]. N Engl J Med，2000，342（18）：1350-1358.

[9] Teraoka H，Sawadda T，Yamashita Y，et al. TGF-betal promotes liver metastasis of pancreatic cancer by modulating the capacity of cellular invasion[J].Int J Oncol，2001，19（4）：709-715.

[10] 張倩，張永明，陸衛(wèi)群，等. 古尼蟲草多糖改善小鼠學習記憶作用的研究[J]. 營養(yǎng)學報，2007，29（4）：393-396.

[11] Kim C S，Lee S Y，Cho S，et al. Cordyceps militaris induces the IL-18 expression via its promoter activation for IFN-γ production[J]. Journal of Ethnopharmacology，2008，120（3）：366-371.

[12] Leung P H，Zhao H，Ho K P，et al. Chemical properties and a ntioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture of Cordyceps sinensis fungus Cs-HK1[J]. Food Chemistry，2009，114（4）：1251-1256.

[13] Liu Y S，Leung P H，Wu J Y. Exopolysaccharide production in batch and semi-continuous fermentation of Cordyceps sinensis[J]. Journal of Biotechnology，2008，136（S1）：S301-S302.

[14] Wu Y L，Hu N，Pan Y J，et al. Isolation and characterization of a mannoglucan from edible Cordyceps sinensis mycelium[J].Carbohydrate Research，2007，342：870-875.

[15] 李連德，樊美珍，李增智. 14種蟲草多糖對果蠅成蟲壽命影響的實驗[J]. 微生物學通報，2000，27：427-428.

[16] 許建明，丁長海，李連德，等.冬蟲夏草多糖保護小鼠免疫性肝損傷的篩選研究[J]. 安徽醫(yī)科大學學報，1999，34：173-175.

[17] Zhu Z Y，Si C L，Zhong Y R，et al. The purification and antioxidative activities in D-galactose-induced aging mice of a water-soluble polysaccharide from cordyceps gunnii（berk.）berk. mycelium[J]. Journal of Food Biochemistry，2011，35（1）：303-322.

[18] Zhu Z Y，Liu N，Si C L，et al. Structure and anti-tumor activity of a high-molecular-weight polysaccharide from cultured mycelium of Cordyceps gunni[J]. Carbohydrate Polymers，2012，88：1072-1076.

[19] Zhu Z Y，Chen J，Si C L，et al. Immunomodulatory effect of polysaccharides from submerged cultured Cordyceps gunnii[J].Pharmaceutical Biology，2012，50（9）：1103-1110.

[20] 朱振元，原靜，李盛峰，等. 古尼蟲草多糖硫酸酯化修飾及其抗氧化活性[J]. 現(xiàn)代食品科技，2011，27（1）：1-5.

[21] Chao C H，Wu H J，Lu M K. Promotion of fungal growth and underlying physiochemical changes of polysaccharides in Rigidoporus ulmarius，an edible Basidiomycete mushroom[J].Carbohydrate Polymers，2011，85：609-614.

[22] Shu C H，Lung M Y. Effect of pH on the production and molecular weight distribution of exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures[J]. Process Biochemistry，2004，39：931-937.

[23] 曹蕾，梁宗琦，劉愛英. 營養(yǎng)條件對古尼蟲草菌絲體生長量的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，1991（3）：5-8.

[24] 傅嵐，黃紅英，陳作紅. 古尼蟲草液體深層發(fā)酵條件的研究[J]. 湖南師范大學：自然科學學報，2004，27（2）：71-74.

[25] 徐桂香，周廣麒，王世龍. 蠶蛹蟲草液體培養(yǎng)基的研究[J].大連輕工業(yè)學院學報，1997，16（4）：14-18.

[26] 王飛，陳柳萌，肖婧，等. 北蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)多糖培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，2007，19（5）：86-87.

[27] 宋樹成，郭如俠. 淺談樣品加標回收率[J]. 水科學與工程技術(shù)，2011（4）：92-93.

[28] 孟祥賢，張志光，劉選明，等. 古尼蟲草生理活性物質(zhì)的檢測與分析[J]. 湖南大學學報：自然科學版，2002，29（1）：13-17.