堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼酶法生產(chǎn)低聚木糖的研究

侯麗芬，孫向陽，丁長河

（1.鄭州旅游職業(yè)學(xué)院，河南鄭州450009；2.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，河南鄭州450011；3.河南工業(yè)大學(xué)，河南鄭州450052）

低聚木糖是功能性低聚糖的一種，具有很強(qiáng)的促雙歧桿菌增殖能力，在促進(jìn)人體自身健康、傳統(tǒng)食品工業(yè)的高新技術(shù)改造、廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品的高附加值轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重要作用。隨著人們對低聚木糖的功能性認(rèn)識的提高，低聚木糖的應(yīng)用范圍會越來越廣，它的市場需求也將逐年增加，發(fā)展前景十分廣闊[1]。木聚糖為生物大分子，在自然狀態(tài)多與其他成分如木質(zhì)素復(fù)合存在。木質(zhì)素被認(rèn)為是酶降解植物細(xì)胞壁的限制因子[2-4]，并且現(xiàn)已證實(shí)木聚糖與木質(zhì)素是通過共價(jià)鍵連接的，其具體連接方式為：木聚糖的阿拉伯糖殘基和葡萄糖醛酸殘基同木質(zhì)素的苯環(huán)通過共價(jià)鍵連接在一起[5-7]。在酶法生產(chǎn)低聚木糖的過程中，與木聚糖結(jié)合的成分會妨礙木聚糖酶的活性中心與木聚糖的接近，影響木聚糖的水解效果，進(jìn)而影響低聚木糖的生成速度和最終產(chǎn)品的得率。因此在進(jìn)行木聚糖的水解之前，必需對原料進(jìn)行處理以削弱木聚糖與其他成分之間的結(jié)合力，從而大大提高酶解生產(chǎn)低聚木糖的效率。本研究以棉籽殼為原料，在堿性H2O2條件下對棉籽殼進(jìn)行處理，通過木聚糖酶降解木聚糖制備低聚木糖，以期為有關(guān)低聚木糖生產(chǎn)與開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

棉籽殼 產(chǎn)地河南省省民權(quán)縣，已經(jīng)粉碎成直徑2mm及以下的顆粒，水分：9.2%，灰分：3.4%；木聚糖酶 BR，Novozymes；3，5-二硝基水楊酸、乙腈 為分析純；其他試劑 為化學(xué)純。

Gel Plate F 254硅膠板 Merck公司；紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿性H2O2預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化 稱取一定量的原料，加入10倍體積，pH11.5（4mol/L NaOH調(diào)）H2O2溶液。

1.2.1.1 堿性H2O2的濃度 堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼：30℃條件下預(yù)處理12h；實(shí)驗(yàn)濃度選擇0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和4.0%。

1.2.1.2 堿性H2O2預(yù)處理時(shí)間 堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼：堿性H2O2濃度2.5%，30℃條件下；預(yù)處理選擇時(shí)間為4、6、8、10、12、24h。

1.2.1.3 堿性H2O2預(yù)處理溫度 堿性H2O2預(yù)處理棉籽殼：堿性H2O2濃度2.5%，預(yù)處理12h；預(yù)處理選擇溫度：30、40、60、80、100℃。

上述預(yù)處理之后，用清水洗至洗出液呈中性，烘干，待用。

1.2.2 酶解參數(shù)的選擇和酶解效果的測定

1.2.2.1 底物的濃度 選擇0.05mol·L-1，pH5.8的檸檬酸緩沖溶液為底物的浸泡液。固定加酶量為原料重量的3.0%，酶解時(shí)間為24h。棉籽殼為底物其料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（W/V）。

1.2.2.2 加酶量和酶解時(shí)間 棉籽殼底物固液比：1∶15（W/V）的前提下，選擇加酶量為底物重量的1%、2%、3%、4%和5%；在每個(gè)加酶量條件下選取酶解時(shí)間：0、0.5、1、2、4、8、12、24h。

1.2.3 樣品中木聚糖含量的測定 500mg待測樣品置于研缽中，加入72%（W/W）的硫酸，研磨1h至樣品完全呈均勻乳狀，將研磨的乳漿狀物全部轉(zhuǎn)入容量瓶中并定容。充分混合均勻后，濾紙過濾，清液用地衣酚-鹽酸法測定總糖含量（mg），按下式計(jì)算木聚糖含量。

木聚糖含量（%）=測定總糖含量×250×0.88/500×100

1.2.4 可溶性木聚糖的測定 地衣酚-鹽酸法。取出提取液若干，加蒸餾水進(jìn)行稀釋至1mL，然后，加入3mL 0.1%的三氯化鐵、0.3mL的1%的地衣酚溶液，加入2mL的蒸餾水，在試管振蕩器上搖勻，沸水浴30min，冷卻，580、670nm測其吸光度。計(jì)算兩者吸光度的差值，代入差值方程，計(jì)算其含量。

木聚糖提取率（%）=可溶性木聚糖含量/原料×100

木聚糖的水解率（%）=酶解后所測得溶液中的木聚糖含量（地衣酚-鹽酸法×0.88）/原料中木聚糖含量×100。

1.2.5 還原糖的測定[8]采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法，具體方法如下：取出提取液若干，加蒸餾水稀釋，然后加DNS試劑，搖勻，沸水浴15min后，立即加入40%的酒石酸鉀鈉，搖勻，冷卻10min，在540nm下測其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算其含量。

1.2.6 糖液中的成分組成確定方法 薄層層析法（TLC）[9]。選擇乙腈和水為展開劑，乙腈∶水=85∶15；顯色劑選擇用5%的硫酸甲醇溶液。樣品上樣量為1.4～4.0μL，展開時(shí)，薄層層析板沒入展開劑5mm左右，兩次展開。顯色劑潤濕后置于130℃烘箱中烘5min左右。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性H2O2預(yù)處理各因素的確定

堿性H2O2去除不同原料中木質(zhì)素的效果對于pH的依賴性較強(qiáng)，據(jù)有關(guān)報(bào)道最適pH為11.5～11.6，如果在堿性更強(qiáng)的條件下其木質(zhì)素的去除率基本上保持不變[10-12]。因此，堿性H2O2溶液的pH確定為11.5。

2.1.1 H2O2濃度的確定

2.1.1.1 不同H2O2濃度對木聚糖含量的影響 選擇不同的H2O2濃度，30℃條件下預(yù)處理12h，棉籽殼的木聚糖含量變化如圖1所示。

經(jīng)不同濃度的H2O2處理后的棉籽殼木聚糖含量，在0%～1.0%范圍內(nèi)增幅較大，在1.0%～2.5%范圍內(nèi)，木聚糖含量較為穩(wěn)定，而在2.5%～4.0%范圍內(nèi)，木聚糖含量又有較大的增幅。這可能是由于棉籽殼中木質(zhì)素含量較高（17.4%），一部分木質(zhì)素在較低的H2O2濃度范圍內(nèi)（0%～1.0%）就可以除去，而另一部分需要更高的H2O2濃度（2.5%～4.0%）才能去除掉。

圖1 不同濃度H2O2處理棉籽殼的木聚糖含量的影響Fig.1 Effect of cottonseed husk treated with different concentration H2O2 on xylan content

2.1.1.2 不同H2O2濃度對酶解效果的影響 經(jīng)過不同濃度H2O2預(yù)處理后的棉籽殼加木聚糖酶（3%），酶解相同時(shí)間（8h），其相對應(yīng)的木聚糖提取率和還原糖含量如圖2所示。由圖2中可以看出，木聚糖提取率和還原糖含量隨著H2O2濃度的增大而升高。圖2中棉籽殼的木聚糖提取率和還原糖含量在H2O2濃度為2.0%時(shí)，是速率增加的轉(zhuǎn)折點(diǎn)；在此點(diǎn)之后其增加速率均減慢。

圖2 不同H2O2濃度對棉籽殼酶解效果的影響Fig.2 Effect of concentration of H2O2 on the effects of enzymatic hydrolysis of cottonseed husk

經(jīng)過堿性H2O2預(yù)處理后的棉籽殼在不同濃度條件下的木聚糖水解率如圖3所示。H2O2濃度在0.5%～2.5%范圍內(nèi)時(shí)，棉籽殼的水解率隨著H2O2濃度的增加而增加，且木聚糖水解率增加幅度較大，而在2.5%之后，木聚糖水解率隨著H2O2濃度的增加而降低。棉籽殼的水解率在H2O2濃度為2.5%時(shí)最大，因此預(yù)處理棉籽殼的H2O2濃度選為2.5%。

圖3 不同H2O2濃度對棉籽殼木聚糖水解率的影響Fig.3 Effect of concentration of H2O2 on cottonseed husk xylan hydrolysis rate influence

2.1.2 H2O2預(yù)處理時(shí)間的確定 不同預(yù)處理時(shí)間對棉籽殼木聚糖含量的影響如圖4所示。不同預(yù)處理時(shí)間處理后的棉籽殼木聚糖含量隨著處理時(shí)間的延長而提高，提高的幅度越來越小。但是隨著預(yù)處理時(shí)間的延長預(yù)處理后的棉籽殼顏色較淡，對于后期的低聚木糖糖液的純化工藝較為有利。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)原料顏色的變化程度而選擇預(yù)處理時(shí)間為12～14h。

圖4 預(yù)處理時(shí)間對棉籽殼木聚糖含量的影響Fig.4 Effect of pretreatment time on cottonseed husk xylan content

2.1.3 預(yù)處理溫度的確定 堿性H2O2預(yù)處理溫度對棉籽殼木聚糖含量的影響如圖5所示。隨著H2O2預(yù)處理溫度的不斷升高，預(yù)處理后的棉籽殼木聚糖含量也漸漸提高，但是其木聚糖含量的升高幅度不大。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是由于棉籽殼本身含有較多的木質(zhì)素（17.4%），使得木聚糖在堿性條件下很難溶出，其木聚糖含量隨著木質(zhì)素等物質(zhì)的去除而略有增大。因此，堿性H2O2預(yù)處理溫度對棉籽殼木聚糖含量影響不大。實(shí)際生產(chǎn)中為了節(jié)省能耗、降低成本，堿性H2O2預(yù)處理溫度選擇30℃。

堿性H2O2法預(yù)處理?xiàng)l件經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)選為：濃度2.5%，時(shí)間12～14h，溫度30℃。在此條件下預(yù)處理得到的棉籽殼木聚糖含量31.7%，這對于木聚糖的提取率是非常重要的。

圖5 預(yù)處理溫度對棉籽殼木聚糖含量的影響Fig.5 Effect of pretreatment temperature on cottonseed husk xylan content

2.2 預(yù)處理后原料酶解條件的研究

2.2.1 底物濃度的確定 預(yù)處理后的棉籽殼在不同的料液比下，水解反應(yīng)24h得到的木聚糖糖提取率和總還原糖如圖6所示。

圖6 料液比對棉籽殼木聚糖提取率和還原糖總量的影響Fig.6 Effect of the ratio of solid to liquid on cottonseed husk xylan extraction rate and total reducting sugar content

從圖6可以看出，當(dāng)料液比為1∶20的條件下，木聚糖的提取率和還原糖總量達(dá)到最高20.0%和150.2mg。當(dāng)料液比1∶20到1∶30時(shí)，木聚糖的提取率和還原糖總量均降低，這可能是因?yàn)樵诘偷孜餄舛葧r(shí)，底物中含有的可被有效水解的木聚糖組分較少，因此影響其最終得到的糖化率和還原糖含量。底物濃度對酶促反應(yīng)具有很大的影響，當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)小于Km值時(shí)，酶反應(yīng)速度與底物濃度成線性關(guān)系，提高底物濃度可以提高反應(yīng)速度。從生產(chǎn)的角度來考慮，底物濃度高對生產(chǎn)成本的降低有好處。棉籽殼在料液比為1∶15和1∶20條件下，木聚糖的提取率和還原糖總量很接近，分別達(dá)到19.6%、149.6mg和20.0%、150.2mg，因此，為了降低實(shí)際生產(chǎn)成本，選擇底物濃度固液比1∶15比較合適。

2.2.2 加酶量和酶解時(shí)間的確定 棉籽殼選擇在加酶量1%、2%、3%、4%和5%（相對于棉籽殼干物料）基礎(chǔ)上反應(yīng)0～24h，所得到的木聚糖提取率和還原糖含量如圖7、圖8所示。木聚糖的提取率和還原糖的含量隨著加酶量的增加而增加。棉籽殼在加酶量1%、2%、3%、4%和5%基礎(chǔ)上反應(yīng)24h時(shí)，其木聚糖提取率和還原糖含量分別為7.5%、15.9%、18.3%、19.7%、22.1%和5.9、9.6、10.1、10.8、10.8mg·mL-1。在加酶量達(dá)到5%時(shí)，酶解所得到棉籽殼的木聚糖水解率為69.8%，而加酶量為3%時(shí)，酶解所得到的棉籽殼木聚糖水解率是57.8%，比加酶量5%時(shí)水解率低12.0%。

圖7 棉籽殼在不同加酶量、不同水解時(shí)間下的木聚糖提取率Fig.7 Extraction rate of xylan of cottonseed husk in different enzyme concentration，hydrolysis time

圖8 棉籽殼在不同加酶量、不同反應(yīng)時(shí)間下的還原糖含量Fig.8 Reducing sugar content of cottonseed husk in different enzyme，different reaction time

雖然加酶量在5%時(shí)得到的棉籽殼木聚糖提取率非常高，但是棉籽殼加酶量5%與3%得到的還原糖含量僅相差0.7mg·mL-1。另外，由于商業(yè)酶價(jià)格較為昂貴，所以根據(jù)圖7、圖8加酶量與木聚糖提取率和還原糖增加的趨勢選擇加酶量為3%。

2.2.3 酶解液薄層層析色譜圖（TLC） 棉籽殼加酶量3%的酶解效果TLC圖見圖9，從圖9可以看出，對照低聚木糖標(biāo)樣，隨著酶解時(shí)間的延長生成的木二糖越多，但是單糖的含量并沒有明顯的增加。另外，如果在反應(yīng)24h基礎(chǔ)上讓反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，可能會在50℃這樣一個(gè)微生物比較容易生長的環(huán)境下糖液被污染，而且酶解時(shí)間過長勢必增加生產(chǎn)周期也不利于提高生產(chǎn)效率，因此，木聚糖酶的酶解時(shí)間可以選為24h。

圖9 木聚糖酶（3%）酶解棉籽殼的TLC圖（s為低聚木糖標(biāo)樣）Fig.9 Xylanase（3%）enzymatic hydrolysis of cottonseed husk TLC diagram

3 結(jié)論

堿性H2O2法預(yù)處理?xiàng)l件為：濃度2.5%，時(shí)間12～14h，溫度30℃。在此條件下預(yù)處理得到的棉籽殼木聚糖含量31.7%。另外，在料液比1∶15的濃度下，加酶量為3%，50℃（木聚糖酶的最適溫度）酶解24h時(shí)，棉籽殼的木聚糖提取率和水解率為18.3%和57.8%。

棉籽殼是農(nóng)業(yè)纖維廢棄物，利用棉籽殼制備功能性低聚木糖，在資源利用、環(huán)境保護(hù)以及促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)調(diào)整等方面均具有重要意義。本研究通過堿性H2O2對棉籽殼進(jìn)行處理，木聚糖酶降解木聚糖制備低聚木糖，達(dá)到了較理想的提取率和水解率，為有關(guān)低聚木糖生產(chǎn)與開發(fā)研究提供了參考。

[1] 肖凱軍，李娜. 不同原料酶法制備低聚木糖的研究及成分分析[J]. 中國食品添加劑，2010（4）：71-76.

[2] Lequart C，Nuzillard JM，Kurek B，et al. Hydrolysis of wheat bran and straw by an endoxylanase：production and structural characterization of cinnamoyl-oligosaccharides[J]. Carbohydrate Research，1999，319：102-111.

[3] Zillox C，Debeire P.Hydrolysis of wheat straw by a thermostable endoxylanase：Adsorption and kinetic studies[J]. Enzyme and Microbial Technology，1998，22：58-63.

[4] Zillox C，Debeire P，Reis D，et al. Immunolocalization of a purified xylanase during hydrolysis of wheat straw stems [J].International Journal of Plant Sciences，1997，158：769-777.

[5] Chesson A，Gordon AH，Lomax JA. Substituent groups linked by alkali -labile bonds to arabinose and xylose residues of legume，grass and cereal straw cell walls and their fate during digestion by rumen microorganisms[J]. J Sci Food Agric，1983，34：1330-1340.

[6] Eriksson OD，Goring AI，Lindgren BO. Structural studies on the chemical bonds between lignins and carbohydrates in spruce wood[J]. Wood Sci Technol，1980，14：267-279.

[7] Das NN，Das SC，Sarkar，et al. Lignin-xylan ester linkage in mesta fiber[J]. Carbohydrate Research，1984，129：197-207.

[8] Bailey MJ，Biely P，Poutanen K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J]. J Biotechnol，1992，23：257-270.

[9] Jiang ZQ，Deng W，Zhu YP，et al. The recombinant xylanase B of Thermotoga maritiama is highly xylan specific and produces exclusively xylobiose from xylans，a unique character for industrial applications[J]. J Mol Cat B Enzymatic，2004，27：207-213.

[10] Gould JM. Alkaline peroxide delignification of agricultural residues to enhance enzymatic saccharification[J]. Biotechnology and Bioengineering，1984，26：46-52.

[11] Gould JM. Studies on the mechanism of alkaline peroxide delignification of agricultural residues[J]. Biotechnology and Bioengineering，1985，27：225-231.

[12] Gould JM，Jasberg BK，Dexter LB，et al. High-fiber，noncaloric flour substitutes for baked foods. Properties of alkaline peroxide-treated ligninocellulose[J]. Cereal Chemistry，1989，66：201-205.