固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜及氣相色譜-嗅聞技術(shù)分析美味牛肝菌風(fēng)味活性物質(zhì)

曹 蓓，齊玉剛，張春霞，劉安軍，王麗霞，鄭 捷，白 云，宋曉娣

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

美味牛肝菌（Boletus edulis）俗稱大腳菇，屬層菌綱，傘菌目，牛肝菌科，牛肝菌屬，子實(shí)體粘軟多汁，香滑可口，富含蛋白質(zhì)維生素多糖類物質(zhì)氨基酸和多種礦物元素，其提取物具有增強(qiáng)免疫力抗癌抗輻射等功能[1]。除營養(yǎng)和藥用外，可食用牛肝菌的的風(fēng)味也引人關(guān)注，其所特有的風(fēng)味異于芳香植物和其他菌類食品。近年來，隨著生活水平的提高和消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，人們在追求攝入食品營養(yǎng)的同時(shí)，對食品風(fēng)味的追求日益增加。對于美味牛肝菌風(fēng)味成分的研究，對于闡明其呈味機(jī)理并且為開發(fā)新一代調(diào)味品奠定理論基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。目前，有關(guān)牛肝菌營養(yǎng)成分的研究較多[2-5]，而對于其揮發(fā)性成分研究較少。頂空固相微萃?。℉S-SPME）方法是把取樣、萃取、富集、進(jìn)樣等過程在同一個(gè)裝置完成。與其他分離方法相比，此方法選擇性好，不需要溶劑，所需樣品用量少，且操作簡單、快速、費(fèi)用低，并可與氣相色譜或液相色譜直接聯(lián)用[6]。氣相色譜-嗅覺測量法（GC-O）是近年來發(fā)展起來的鑒定食品風(fēng)味活性物質(zhì)的技術(shù)手段，這種方法彌補(bǔ)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）不能檢測到一些閾值很低的痕量風(fēng)味物質(zhì)的缺陷。本實(shí)驗(yàn)以美味牛肝菌為原料，通過HS-SPME技術(shù)萃取樣品中的揮發(fā)性成分，并將GCMS與GC-O方法結(jié)合起來，對樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量及風(fēng)味活性成分分析，為牛肝菌調(diào)味品的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美味牛肝菌干品 購于昆明農(nóng)貿(mào)市場，將樣品粉碎，過40目篩；C6～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 德國Sigma公司。

4000MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國瓦里安Varian 技術(shù)有限公司；Sniffer 系列嗅覺計(jì) 瑞士Brechbuhler公司；手動固相微萃取進(jìn)樣器、65μm PDMS/DVB萃取頭、15mL頂空進(jìn)樣瓶 美國Supelco公司；高速中藥粉碎機(jī) 武義縣屹立工具有限公司；電子分析天平 上海精天電子儀器有限公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津玻璃儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HS-SPME處理 稱取樣品粉末2.0g置于15mL頂空樣品瓶中，用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封，置于45℃水浴鍋中平衡30min后，將經(jīng)過老化處理的固相微萃取頭通過瓶蓋的橡皮墊插入到樣品瓶中大約1cm處，推出纖維頭。于45℃水浴中萃取30min后，將萃取頭迅速插入GC-MS聯(lián)用儀的進(jìn)樣口，于250℃下解析15min，同時(shí)啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

1.2.2 GC-MS分析條件 色譜條件：色譜柱型號為VF-5ms（30m×0.25mm×0.25μm），載氣為高純度氦氣（99.999%），流速為1mL/min，進(jìn)樣口溫度為250℃，進(jìn)樣時(shí)以分流方式進(jìn)樣。采用兩段式程序升溫：起始溫度為40℃，保持3min，然后以4.0℃min升溫至150℃，并保持1min，再以8℃/min升溫至250℃，保持6min。

質(zhì)譜條件：電離源為EI，離子阱溫度為220℃，GC-MS傳輸線溫度為280℃，EI電子能量為70eV，溶劑延遲時(shí)間1.5min。掃描方式為全掃描（fμμ），范圍為43～500m/z。

1.2.3 定性分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由Xaclbiur軟件系統(tǒng)完成，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NSIT05譜庫（107k compounds）相匹配，僅當(dāng)正反匹配度均大于800（最大值為1000）的鑒定結(jié)果才予以報(bào)道。采用相同的升溫程序，以C6～C20的正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，以其保留時(shí)間計(jì)算樣品測試中的化合物的保留指數(shù)，再通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，與文獻(xiàn)中的化合物的保留指數(shù)（RI）相比較，與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果共同定性。

化合物保留指數(shù)RI計(jì)算公式：

式中，RI樣品—樣品色譜峰的RI；RI前—樣品色譜峰前面烷烴標(biāo)樣的RI；Rt樣品—樣品色譜峰的Rt；Rt前—前面烷烴標(biāo)樣的Rt；Rt后—后面烷烴標(biāo)樣的Rt；Rt—色譜峰的保留時(shí)間。

1.2.4 定量分析 通過Xaclbiur工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，從而得出各化學(xué)成分在美味牛肝菌物質(zhì)中的相對百分含量。

1.2.5 GC-O分析 樣品前處理同樣采用HS-SPME方法，同1.2.1；色譜條件和質(zhì)譜條件同1.2.2；色譜柱與嗅聞口的分流比設(shè)置為1∶1。本實(shí)驗(yàn)選擇5名有經(jīng)驗(yàn)的感官評價(jià)員進(jìn)行嗅覺分析，記錄風(fēng)味特征和強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)過程中至少有3名感官評價(jià)員在同一嗅聞時(shí)間處能得到相同的感官描述，則將該記錄記入最終結(jié)果，氣味的強(qiáng)度以星號個(gè)數(shù)做記號。沒有嗅聞到氣味不計(jì)星號，“*”表示該化合物氣味微弱，“**”表示該化合物氣味中等，“***”表示該化合物氣味強(qiáng)烈。統(tǒng)計(jì)5位感官評價(jià)員對記入最終結(jié)果的每種化合物所進(jìn)行的星號標(biāo)記，最后計(jì)算每種氣味成分所得星號的平均值（四舍五入取整），作為該化合物氣味強(qiáng)度的最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中感官評價(jià)員輪流分析，以避免嗅覺疲勞。

2 結(jié)果與分析

2.1 美味牛肝菌的揮發(fā)性成分鑒定

美味牛肝菌揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖見圖1。從圖1可見，在此分析條件下得到的圖譜分離度和定量準(zhǔn)確度均較好。通過NSIT05譜庫進(jìn)行匹配度和圖譜比較，初步確定樣品中揮發(fā)性成分。同時(shí)，根據(jù)Kovats計(jì)算式，得到各未知物的RI實(shí)驗(yàn)測得值。然后在NSIT05譜庫數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（www.webbook.nist.gov）、（www.odour.org.uk）和相關(guān)文獻(xiàn)資料中檢索各未知物的RI值，進(jìn)行比較，進(jìn)一步確認(rèn)樣品中的揮發(fā)性成分，見表1。其中，C6～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與對應(yīng)RI值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖1 美味牛肝菌揮發(fā)性成分GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Boletus edulis

圖2 C6～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)-保留時(shí)間圖Fig.2 Retention index（RI）and retention time（RT）relations of C6～C20 hydrocarbon standard compounds

由表1中可知，從美味牛肝菌中分離鑒定得到53種揮發(fā)性化合物，主要由吡嗪類、烴類、醇類、酮類、醛類、酸類、酯類、含硫類、呋喃等化合物組成。其中含量最高的吡嗪類化合物有12 種，占總成分的58.87%；其次酸類化合物有4種，占總成分的5.15%；醛類化合物有5種，占總成分的4.73%；烴類化合物有

9種，占總成分的3.57%；酯類化合物有2種，占總成分的3.36%；醇類化合物有6種，占總成分的2.95%；酮類化合物有6種，占總物質(zhì)的2.49%；同時(shí)，一些雜環(huán)及其他化合物含量也很高，如2-噻吩甲醛（10.50%）、2-正戊己呋喃（2.296%）、2-乙酰基吡咯（1.963%）等。在這53種揮發(fā)性成分中，相對含量較高的有2，6-二甲基吡嗪、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪、2-噻吩甲醛、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、丙位戊內(nèi)酯、己醛、2-戊基呋喃、甲酚、4-羥基-2-酮丁酸、1-辛烯-3-醇、2-乙?；量?、異丙烯基吡嗪、2-十一酮、甲基吡嗪、苯甲醛、己酸、2，5-二甲基-3-異戊基吡嗪和檸檬烯。

表1 牛肝菌揮發(fā)性成分的分析及鑒定結(jié)果Table 1 Analysis and identification of volatile components of Boletus

2.2 美味牛肝菌的特征性風(fēng)味物質(zhì)鑒定

僅通過各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量不能確定美味牛肝菌的特征性揮發(fā)性化合物，還需要利用GC-O來鑒定對風(fēng)味有貢獻(xiàn)的物質(zhì)，分析鑒定結(jié)果列于表2。

如表2所示，在53種已定性的美味牛肝菌揮發(fā)性成分中，有29種可被感官評價(jià)員嗅聞到，此外還有3種未知化合物呈現(xiàn)特殊氣味，但是不能被GC-MS檢測到，這是因?yàn)檫@些化合物閾值較低，且在樣品中的含量極低，不能為質(zhì)譜所鑒定。分析結(jié)果表明，美味牛肝菌的特征性風(fēng)味主要以堅(jiān)果香、烤肉香、蘑菇味、花香、烤面包香味等風(fēng)味特征為主。這些風(fēng)味主要由吡嗪類、醛類、醇類、酮類等化合物釋放出來的。

吡嗪類化合物是美味牛肝菌中鑒定出來的種類最多、含量最豐富的揮發(fā)性化合物，且由于其閾值較低，普遍帶有令人愉悅的堅(jiān)果、燒烤等氣味，對美味牛肝菌特征性風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大。吡嗪類化合物是美味牛肝菌中的糖及其分解產(chǎn)物與氨基酸發(fā)生了美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[18]，樣品中檢測到大量這類化合物，可能是美味牛肝菌在干制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)。Thomas[19]在干制牛肝菌中也檢測到了9種吡嗪類化合物，其中有4種與本實(shí)驗(yàn)檢測到的一致。2-戊基呋喃也是閾值很低（4×10-9g/mL）的含氮雜環(huán)化合物，具有豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜的香韻[20]，對美味牛肝菌的香氣也有很大貢獻(xiàn)。

醛類化合物也是美味牛肝菌香氣的重要的成分，如樣品中檢測到的己醛、苯甲醛、苯乙醛等。這些醛類化合物主要是脂質(zhì)的氧化或氨基酸的strecker降解生成的[21]，一般閾值都較低，己醛的閾值為4.5×10-9g/mL[22]，是中等分子質(zhì)量的醛，具有清香、酯香風(fēng)味，在樣品中提供了青草香氣。苯甲醛、苯乙醛屬于芳香醛，由苯丙氨酸降解生成[23]，具有令人愉悅的杏仁香和花香。酮類化合物的生成和醛類化合物類似，具有獨(dú)特的清香和果香風(fēng)味，且閾值較低[24]，對美味牛肝菌的花香、果香風(fēng)味有貢獻(xiàn)。

醇類化合物多為脂質(zhì)氧化或羰基化合物還原生成的，通常具有芳香、植物香、酸敗和土腥味，因其自身的閾值對食品風(fēng)味的貢獻(xiàn)很小，但某些不飽和醇類卻是食品香氣的重要組成部分。1-辛烯-3-醇是八碳化合物的代表，八碳化合物對食用菌的風(fēng)味有著直接的影響，這些短鏈的八碳化合物，是由不飽和脂肪酸，尤其以亞油酸和亞麻酸為主，經(jīng)脂肪氧化酶催化轉(zhuǎn)變而成的。1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇風(fēng)味，素有“蘑菇醇”稱號，它幾乎存在于所有品種的食用菌中，在美味牛肝菌中，1-辛烯-3-醇相對含量為2.059%，且氣味強(qiáng)度很大，對其呈味有非常重要的作用。

一般來講，飽和烴類化合物的閾值都較高，對食品的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。但是萜烯類化合物相對飽和烴類閾值較小，具有一定風(fēng)味。如長葉烯具有松節(jié)油香氣，檸檬烯具有橙皮清香，對美味牛肝菌的風(fēng)味呈現(xiàn)均有一定貢獻(xiàn)。

表2 美味牛肝菌中特征性揮發(fā)性化合物的分析及鑒定結(jié)果Table 2 Analysis and identification of specific volatile components in Boletus edulis

在美味牛肝菌特征性揮發(fā)性化合物中還有一類含硫化合物，如3-甲硫基丙醛、2-噻吩甲醛，這類化合物是含硫氨基酸降解產(chǎn)生的，呈現(xiàn)一種硫化物氣味。此外，還有一些酸類、酯類、酚類及一些未知化合物在牛肝菌香氣中起著調(diào)和互補(bǔ)的作用，共同構(gòu)成了美味牛肝菌的風(fēng)味特征。

3 結(jié)論

本研究使用HS-SPME方法對美味牛肝菌的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，再通過GC-MS對其揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，并結(jié)合保留指數(shù)鑒定出53種化合物，其中有12種吡嗪類化合物，占總揮發(fā)性成分的58.87%，是美味牛肝菌的主要揮發(fā)性成分。美味牛肝菌揮發(fā)性成分中含量較高的化合物有2，6-二甲基吡嗪（30.09%）、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪（13.32%）、2-噻吩甲醛（10.50%）、2-乙基-3-甲基吡嗪（5.35%）、2-乙基-6-甲基吡嗪（4.06%）、丙位戊內(nèi)酯（3.34%）、己醛（2.54%）、2-正戊基呋喃（2.30%）等。

通過GC-O方法鑒定美味牛肝菌的特征性揮發(fā)性物質(zhì)，共得到32種特征性香氣成分，其中有3種物質(zhì)不能通過GC-MS檢測到。通過對美味牛肝菌特征性揮發(fā)性化合物的氣味強(qiáng)度進(jìn)行記錄，氣味強(qiáng)度較大的主要有己醛（青草味）、甲基吡嗪（堅(jiān)果香味）、3-甲硫基丙醛（焦香）、2，6-二甲基吡嗪（烤肉香）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味）、2-戊基呋喃（豆香）、2-乙基-6-甲基吡嗪（烤香）、3-辛烯-2-酮（蘑菇味）、苯乙醛（花香）等化合物，它們對美味牛肝菌的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)很大，是主要的揮發(fā)性風(fēng)味活性物質(zhì)。

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