面粉添加劑偶氮甲酰胺代謝物聯二脲的HPLC-MS/MS檢測

袁麗紅，丁洪流，陳 英，姚衛(wèi)蓉，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.蘇州市產品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇蘇州215104）

一直以來，偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，簡稱ADA）被認為具有在低用量下實現安全快速氧化的效能，能改善面團的物理操作性質，使得面團中形成高筋力面團所需的組織結構，適用于做小麥粉處理劑和焙烤食品的快速發(fā)酵劑[1-2]。但是，近期有大量研究表明經過加工之后ADA的代謝產物并不安全。ADA在改善面粉品質的同時也會在高溫熱解條件下產生其他有害副產物氨基脲（semiearbazide，簡稱SEM）[3-4]；ADA還可經小麥蛋白還原可轉化為聯二脲（biurea，簡稱HDC），HDC進一步降解又可轉化為SEM[5-6]，其轉化規(guī)律和分子結構見圖1。研究表明，SEM具有致癌性和誘變性[7-9]，歐盟國家已經禁止使用ADA[10]。但關于HDC毒性目前未見報道。因此，目前大部分研究報道主要是通過監(jiān)控ADA和SEM的量來研究其轉化規(guī)律。由于HDC既是ADA的轉化產物又是ADA與SEM轉化的中間產物，其含量的監(jiān)控對于準確了解ADA在加工過程的代謝規(guī)律起著重要作用。目前關于HDC的檢測方法僅有兩篇報道，謝黨[11]采用亞鈦還原法檢測工業(yè)原料中HDC的含量；Mulder等[12]用13C，15N2-SEM和13C-氰化鉀合成了內標標準物13C，15N2-HDC，建立了針對HDC的HPLC-MS/MS內標定量方法，檢測限達到10μg/kg，回收率80%。該文由于提取液未經凈化，雜質含量較多而產生離子抑制現象，從而選擇了內標定量法，同時也研究了稀釋倍數對離子抑制現象的影響，得出稀釋倍數大于200倍時，離子抑制現象最弱。鑒于該方法內標物合成過程復雜、成本昂貴，以及驗證得出可通過增加稀釋倍數降低離子抑制，而且添加ADA的面制品中HDC含量為ppm級，含量高于質譜檢測所需的ppb級，通過稀釋起到一定的降低離子抑制作用，本文擬采用固相萃?。⊿PE）凈化提取液，以期通過除去溶液中雜質達到降低離子抑制的目的，從而無需內標物進行定量。本文通過研究HDC提取、SPE柱子的選擇、液相分離條件、質譜檢測條件等，建立針對SPE凈化再采用HPLCMS/MS方法定量檢測，以期為面制品中HDC檢測提供一種可操作性強的簡便方法。

圖1 偶氮甲酰胺（ADA）、聯二脲（HDC）、氨基脲（SEM）的轉化規(guī)律、分子結構圖及SEM檢測衍生原理Fig.1 The molecule structure and metobolism of azodicarbonamide，biurea，semiearbazide and derivative principle during SEM detection

1 材料與方法

1.1 材料與設備

HDC標準儲備溶液 稱取0.05g（精確到0.0001g）HDC標準物質，用純水超聲溶解，定溶于100mL容量瓶中，制成0.5mg/mL標準儲備液，4℃保存；乙腈、甲醇 色譜純，美國TEDIA試劑公司；聯二脲標準品 純度均不小于99.0%，上海安譜公司；饅頭 蘇州超市。

液相色譜串聯質譜儀 島津高效液相色譜儀，日本島津公司；AB SCIEX 4000 QTRAP 質譜儀 美國AB公司；色譜柱 XBridge BEH Amide色譜柱（3.5μm，4.6mm×150mm），美國Waters公司；SPE固相萃取柱 LC-18 SPE（500mg/3mL）小柱，上海安譜公司；IKA VORTEX 3漩渦混勻器 上海吉延環(huán)境儀器有限公司；TG16-WS離心機 上海盧湘離心機儀器有限公司；超聲儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC-MS/MS檢測條件

1.2.1.1 色譜條件 采用XBridge BEH Amide色譜柱（3.5μm，4.6mm×150mm）；柱溫：35℃；流動相：等度洗脫，V（CH3CN）∶V（H2O）=70∶30；流速：0.6mL/min；時間：8min。

1.2.1.2 質譜條件 電噴霧ESI，正離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測MRM；離子噴霧電壓（Ion Spray Voltage）：5500V；離子源溫度T：600℃；霧化氣Gas1：55。MRM掃描參數如表1所示。

表1 HDC的MRM掃描參數Table 1 The MRM scan parameters of HDC

1.2.2 樣品前處理 準確稱取樣品0.5g（精確到0.0001g），加入20mL 純水，利用超聲提取20min。4500r/min離心5min，取1mL上清液定容至30mL，準確取2mL稀釋液過LC-18固相萃取小柱進行凈化，棄去流出液，最后用5mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液，氮吹吹至干，準確取1mL純水定容，過0.22μm水相膜，待用。

LC-18固相萃取小柱在使用之前先用3mL甲醇、3mL水進行活化。

1.2.3 標準曲線與最低檢出限 用去離子水稀釋HDC標準儲備溶液，配制最終濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/L的標準溶液，并直接進行HPLC-MS/MS測定。以HDC濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。通過不斷降低標準溶液濃度，取信噪比為3時的濃度為最低檢出限。

1.2.4 回收率和精密度的測定 準確稱取3份空白面粉0.5g（精確至0.0001g）作為基質，分別添加HDC標準溶液，使得面粉中HDC含量分別為2.0、5.0、10.0μg/kg，按照樣品前處理步驟進行處理，每個濃度水平下做3個平行實驗，再按照HPLC-MS/MS檢測條件進行檢測，測定該方法的回收率與精密度。

2 結果與討論

2.1 質譜條件

本文研究了HDC的質譜條件，證明HDC母離子（[M+H]+：m/z119）在正電噴霧條件下有較強的靈敏度，所以本文選擇正電離模式ESI。HDC在正電離模式下的MS/MS子離子掃描圖以及結構圖如圖2所示。

圖2 HDC正電離模式MS/MS子離子掃描圖及其結構圖Fig.2 Product ion scan ESI MS/MS of HDC and the structures of the major fragment ions

2.2 色譜柱的選擇

通過對比Hypersil ODS2色譜柱、XBridge BEH Amide色譜柱以及MACHEREY-NAGEL Nucleosil氰基柱三種正反相色譜柱對HDC的保留情況（見圖3），證明XBridge BEH Amide色譜柱效果最好。因為HDC極性較強，在Hypersil ODS2反相色譜柱上沒有保留；而在正相色譜柱上均有保留，且在XBridge BEH Amide色譜柱的峰形與響應強度比MACHEREY-NAGEL Nucleosil氰基柱的效果好，因此，為了有較好的檢測效果，本實驗采用XBridge BEH Amide色譜柱。

圖3 HDC在不同色譜柱上的分離效果Fig.3 The chromatograms of HDC on different columns

2.3 流動相的選擇

HPLC-MS/MS中常用乙腈與加入微量甲酸或乙酸的水溶液作為流動相，因為微量的酸可以促進物質電離，因此選擇了乙腈作為有機相。通過對比0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液和純水作為水相時HDC的色譜峰（見圖4），說明用純水作為水相時，色譜峰相應最高，峰形高而窄，且沒有分叉。其原因可能是因為所選色譜柱為氨基柱，酸溶液對其柱效有較大影響。綜上所述，選擇乙腈作為有機相，純水作為水相。

圖4 不同流動相對HDC色譜峰的影響Fig.4 The effects of different mobile phases on the chromatogram of HDC

2.4 流動相比例與流速的選擇

根據上述選出的流動相，通過不斷的調整乙腈與水的比例，對不同比例流動相條件下HDC響應值與峰形進行了比較（見圖5），得出當流動相V（CH3CN）∶V（H2O）=70∶30時，其分離效果與響應值最好，本研究以此作為所需流動相比例。選用上述選好的流動相比例，比較了流速0.8mL/min與0.6mL/min對分離效果的影響，發(fā)現改變流速對二者的分離與峰形影響不大，最終選用0.6mL/min，以節(jié)約溶劑。

圖5 不同比例流動相對HDC色譜峰的影響Fig.5 The effect of different ratios of mobile phase on the chromatograms of HDC

2.5 線性范圍與檢出限

根據上述條件，采用HPLC-MS/MS檢測HDC的線性范圍為0.5～20μg/kg，線性方程為Y=3594.2+19523X，相關系數為0.9992，最低檢出限為0.1μg/kg。

圖6 HPLC-MS/MS分析HDC的標準曲線Fig.6 The standard curve of detection HDC by HPLC-MS/MS

2.6 HDC提取溶劑與提取方式的選擇

圖7 不同提取溶劑與不同提取方式對HDC提取效果的影響Fig.7 The effect of different extraction solvents and extraction methods on the recovery ratio of HDC

由于HDC微溶于水、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），不溶于多數有機試劑，但鑒于DMF粘度很大，因此，分別選用極性較強的水、甲醇、乙腈、5% DMF水溶液作為提取溶劑，以及振蕩提取、超聲提取與渦旋提取三種提取方式對加標饅頭進行了提取效果研究。根據圖7可知，采用水與5% DMF作為提取溶劑、超聲作為提取方式時，提取效果最好且相當，考慮到DMF粘度大，對色譜柱有影響，所以選擇水作為提取溶劑。

2.7 固相萃取小柱及洗脫液的選擇

分別將HDC加標面粉提取溶液通過Poly-Sery HLB SPE、NH2SPE、HC-18 SPE與LC-18 SPE四種固相萃取小柱，研究四種小柱對HDC的保留情況，結果表明，HDC在LC-18 SPE小柱上有較好的保留。由于合適的洗脫溶劑對于HDC檢測的效果以及回收率有著較大的影響，本文分別將甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯作為洗脫液，研究了不同洗脫液對HDC的洗脫效果。結果表明，使用甲醇作為洗脫液時，HDC回收率最高，可達到90%以上。因此，選用LC-18 SPE（500mg/3mL）小柱，甲醇作為洗脫溶劑。

表2 LC-18 SPE不同洗脫液HDC回收率測定結果Table 2 The recovery ratio of HDC on LC-18 SPE by different eluents

2.8 精密度與回收率

回收率與精密度測定結果見表3，回收率為89.00%～102.73%，大于Mulder等[12]方法回收率80%，相對標準偏差均小于5.0%，說明本研究建立的方法可靠。

表3 加標面粉HDC回收率和精密度測定結果（n=5）Table 3 The average recovery and relative standard deviation of samples（n=5）

2.9 實際樣品測定

因為面粉中ADA經過加工之后全部進行代謝生成HDC、SEM[5-6]，因此在面制品中檢測不到ADA。應用本方法對10批次市售饅頭中的HDC進行檢測，以追蹤是否添加了ADA進行。結果表明，多數樣品未檢出HDC，只有2個樣品檢出含有HDC，證明在該饅頭原料面粉原料中含有ADA。

表4 市售饅頭中HDC含量的測定結果Table 4 The content of HDC in market steamed bread

3 結論

本研究結果表明，采用HPLC-MS/MS法檢測面制品中HDC，其線性方程為Y=3594.19+19522.69X，相關系數為0.9992，回收率為89.00%～102.73%，操作方法簡單快捷，靈敏度高。

本次實驗建立的利用HPLC-MS/MS法檢測面制品中HDC的檢測方法可以為今后進一步研究ADA與HDC、SEM的轉化機理提供基礎方法，為面粉添加劑的安全性評價提供理論依據。

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