大鼠肝臟在四氯化碳作用下NF－κB與CXCR1表達(dá)的研究

肝纖維化是肝病的典型表現(xiàn)形式，作為機(jī)體的自我保護(hù)作用，是生物體抵抗損傷所進(jìn)行的一種反應(yīng)。但是在疾病進(jìn)程中，如果肝纖維化不能得到有效控制，在患者有可能發(fā)展為肝硬化。治療肝纖維化最有效的方法，除清除病毒，減少肝細(xì)胞損傷外，比較關(guān)鍵的是扭轉(zhuǎn)纖維化，恢復(fù)肝臟正常結(jié)構(gòu)及功能。因而，導(dǎo)致肝纖維化的分子機(jī)制的研究便凸顯出積極的意義。但是研究發(fā)現(xiàn)，無論是靜止期還是活動(dòng)期，肝星狀細(xì)胞（HSC）能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子。靜止型HSC能夠被腫瘤壞死因子TNF所誘導(dǎo)，從而表達(dá)MCP－1，同時(shí)在氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的作用下，活化型HSC能夠表達(dá)其他類型的趨化因子［1］。NF－κB和趨化因子在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，有大量的證據(jù)表明趨化因子及其受體在造血、血管生成、惡性腫瘤、HIV的侵染、炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。然而，它們也在肝纖維化的發(fā)生中起到推波助瀾的作用。但是它們?cè)诟螕p傷后經(jīng)歷怎樣的變化，目前還不是很清楚。本文就大鼠肝臟在四氯化碳損傷后研究NF－κB與CXCR1表達(dá)的變化，以期為臨床治療肝纖維化提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組 11周齡雄性健康SD大鼠30只，體重約為200g左右（購(gòu)自交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。隨機(jī)分為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組兩組。各組大鼠在相同的濕度、溫度、光照條件下飼養(yǎng)進(jìn)行適應(yīng)性1周后，實(shí)驗(yàn)組使用植物油配置的50%四氯化碳溶液腹腔注射，對(duì)照組直接腹腔注射植物油，每周1次，共計(jì)9周。分別在第3周，第6周，第9周隨機(jī)從兩組中各取出5只進(jìn)行病理、分子生物學(xué)方面的檢查。

2 組織病理學(xué)檢測(cè) 分別在第3周，第6周，第9周取材，采用10%水合氯醛（3．5mg／kg）腹腔注射，麻醉大鼠。取肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。照相顯微鏡觀察并記錄。

3 RT－PCR檢測(cè) 取在液氮中保存的組織，加適量液氮研磨組織，再加入RNA提取液Trizol（1ml／50～100mg組織），繼續(xù)研磨至勻漿形成?？俁NA的量檢測(cè)以RNA OD值計(jì)算，加入的量為1000ng的總RNA。普通PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。GAPDH：上游：5′－CACGGCAAGTTCAATGGCACA－3′，下 游：5′－GAATTGTGAGGGAGAGTGCTC－3′；NF－κB：上游：5′－CACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC－3′，下游：5′－CCGGACTCCGTGATGTCTAAGTACT－3′；CXCR1：上 游：5′－TTGGAAATATCACCCGAATGCTG－3′， 下 游： 5′－AAGATGGCAAAAGGCAGAGAC－3′。95℃預(yù)變性結(jié)束后，進(jìn)行2步PCR循環(huán)，并檢測(cè)熒光信號(hào)，95℃變性5s，60℃復(fù)性延伸45s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。以上程序結(jié)束后，分析溶解曲線，確定產(chǎn)物的溶解溫度，95℃完全變性10s，60℃進(jìn)行復(fù)性30s，然后再升溫到90℃15s，檢測(cè)完畢。分析運(yùn)行結(jié)果，分析并觀察樣本的Ct值。依據(jù)結(jié)果采用待測(cè)基因的拷貝數(shù)與內(nèi)參GAPDH基因的拷貝數(shù)的比值來表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

4 Western blot檢測(cè) 用預(yù)冷的蛋白裂解液［含125mmol／L Tris－HCl，5% （w／v）SDS，24．75%甘油］裂解肝組織，作用時(shí)間為30min，待裂解結(jié)束后，組織勻漿移到無菌離心管，離心12000rpm，4℃，共計(jì)20 min。棄沉淀，將上清液。加入蛋白上樣緩沖液于蛋白樣品（4︰1），用水煮沸8min。低溫冷凍離心機(jī)上離心，12000rpm，4℃，10min，取上清液。按照試劑盒的介紹方法，用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行檢測(cè)。每孔總蛋白上樣量30μg，10%SDS聚丙烯纖胺凝膠電泳2h，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2h，用封閉液稀釋一抗（NF－κB和CXCR1）到適宜濃度，將稀釋的抗體加入到平皿中，用濾紙吸凈從封閉液取出的PVDF膜表面的液體，吸干后膜覆蓋在稀釋后的抗體上，4℃過夜?？贵w孵育結(jié)束后，倒掉抗體，PBST洗脫膜，每次15min，共3次。同法加入二抗，用PBST洗完之后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。β－actin作為內(nèi)參。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 病理學(xué)觀察 見圖1。與正常對(duì)照組相比，四氯化碳注射組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠的生活狀態(tài)發(fā)生變化，飲食不振，精神萎靡等。在病理圖片中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝臟逐漸發(fā)生腫脹現(xiàn)象，和正常組相比，顏色由鮮紅變?yōu)榘导t色，最后，變?yōu)闇\灰色，同時(shí)肝臟的體積發(fā)生萎縮現(xiàn)象，體積變小，同時(shí)伴隨著肝臟質(zhì)地變硬。從病理圖片上還能發(fā)現(xiàn)，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，輕度的脂肪變化，肝細(xì)胞點(diǎn)狀、灶狀壞死，炎癥細(xì)胞增多，細(xì)胞間纖維增生。

圖1 四氯化碳對(duì)大鼠肝臟的影響

2 四氯化碳對(duì)大鼠肝臟NF－κB和CXCR1mRNA表達(dá)的影響 對(duì)照組、四氯化碳處理組在3周、6周、9周組中肝臟NF－κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為：8．27×10－5，9．14×10－5，9．62×10－5，2．34×10－4；CXCR1的相對(duì)表達(dá)量分別為：8．07×10－4，1．78×10－3，2．98×10－3，4．27×10－3，可見四氯化碳處理9周組NF－κB和CXCR4的表達(dá)量顯著的高于對(duì)照組，其中的NF－κB升高最為明顯（圖2～5）。

圖2 NF－κB的擴(kuò)增曲線

圖3 CXCR1的擴(kuò)增曲線

圖4 不同處理組肝臟組織中NF－κB mRNA的相對(duì)表達(dá)水平變化

3 四氯化碳對(duì)大鼠肝臟NF－κB、CXCR1蛋白表達(dá)水平的影響 經(jīng)過對(duì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，采用相應(yīng)的軟件分析后，經(jīng)過計(jì)算發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組、四氯化碳處理3周組、6周組、9周組肝臟中NF－κB的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為：0．13±0．02、0．12±0．03、0．29±0．01、0．58±0．02；CXCR1的相對(duì)表達(dá)量表達(dá)量分別為：0．19±0．05、0．29±0．02、0．41±0．03、0．58±0．06。四氯化碳處理組，NF－κB和CXCR1的表達(dá)量都明顯高于正常對(duì)照組。

圖5 不同處理組肝臟組織中CXCR1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平變化

討 論

從上述結(jié)果可以看出，與對(duì)照組相比，四氯化碳處理組中NF－κB與CXCR1在肝臟中的表達(dá)無論是在mRNA的核酸水平上還是在蛋白水平上都呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，雖然升高的程度有所差別，尤其是在四氯化碳處理組中的第9周組表現(xiàn)最為明顯。通過比較發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)NF－κB在肝臟損傷中的表達(dá)量升高的趨勢(shì)明顯比趨化因子受體CXCR1升高的快。大鼠肝臟在四氯化碳刺激下，大鼠肝臟中的NF－κB與CXCR1的表達(dá)量隨著四氯化碳的作用時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，在兩者共同作用下，同時(shí)在其他的炎癥因子或者炎癥抑制因子的共同作用下，在肝臟受到損傷時(shí)，起到積極的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠的肝細(xì)胞在CCl4的刺激下，在細(xì)胞中能夠產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白－1（MCP－1），而且該因子被證實(shí)主要在HSC中表達(dá)［2］。HSC在趨化因子的作用下，參與了肝組織損傷和修復(fù)的一系列反應(yīng)，在肝慢性炎癥和纖維化形成中發(fā)揮著重要的作用。大量的研究證實(shí)，炎癥不僅是與慢性肝病聯(lián)系密切，同時(shí)他還能極促進(jìn)疾病進(jìn)展［3－5］。大于80%的肝癌患者伴隨著發(fā)生肝硬化或纖維化，從而在慢性肝細(xì)胞損傷、再生，炎性細(xì)胞的滲透作用和活化的肌成纖維細(xì)胞的豐度方面有這一定的發(fā)展［6］。

NF－κB在不同的細(xì)胞組成中具有廣泛的功能，能夠影響肝細(xì)胞的存活，枯夫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及造血干細(xì)胞細(xì)的存活，炎癥反應(yīng)及細(xì)胞活性。NF－κB在肝臟中所擔(dān)負(fù)的關(guān)鍵角色已被證實(shí)，通過基因敲除小鼠模型中的一些NF－κB調(diào)節(jié)因子，從而導(dǎo)致肝臟的自發(fā)性肝損傷，肝纖維化和肝癌。該研究不僅能夠突出NF－κB在肝臟疾病過程的重要作用，同時(shí)也能夠揭示也強(qiáng)調(diào)肝損傷，炎癥，纖維化和肝癌之間潛在的分子機(jī)制。

肝纖維化是不同致病因素導(dǎo)致的慢性肝損傷的結(jié)果。雖然肝纖維化通常在停止傷害后反轉(zhuǎn)，但是如果這種病得不到及時(shí)治療，任其繼續(xù)發(fā)展，最終會(huì)導(dǎo)致肝硬化，這種情況通常是無法改變的［6］。多種炎癥介質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中存在一個(gè)或多個(gè)κB序列，如 TNF－α、IL－1、IL－2、IL－6、IL－8、G－CSF、GM－CSF、ICAM－1、VCAM－1（血管細(xì)胞粘附分子）、ELAM－1（內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞粘附分子）等?；罨腘F－κB則參與它們的基因表達(dá)，引起多種細(xì)胞因子的表達(dá)增高，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及炎癥過程。NF－κB調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生主要是通過三個(gè)不同的方面來進(jìn)行：①通過對(duì)損傷的肝細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)肝臟纖維化做出一定的響應(yīng)；②通過調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路，激活肝臟中的巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞；③通過調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞中的纖維化反應(yīng)。綜上所述，NF－κB活性在肝臟中的減少或缺失致肝細(xì)胞損傷和隨后的纖維化程度的增加。在本實(shí)驗(yàn)中，通過四氯化碳作用引起大鼠肝損傷，從病理切片中能夠明顯的觀察到相關(guān)的現(xiàn)象，同時(shí)通過在核酸和分子水平上進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NF－κB和趨化因子受體的表達(dá)水平上都發(fā)生變化，雖然變化程度不一樣，但是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者呈正相關(guān)性。

白介素－8受體α是趨化因子受體，主要表達(dá)在免疫細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞以及上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞表面上。是具有7次跨膜域的受體，屬G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族成員，與配對(duì)的趨化因子結(jié)合，通過G蛋白變構(gòu)激活下游的效應(yīng)分子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能。按照結(jié)構(gòu)可分為CXCR、CCR、CR和CX3CR四個(gè)亞類。CXCR1是CXCR家族的主要成員之一，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞表面，在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。此外，該受體激活可以調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、血管生成等作用。Murdoch等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在HBV導(dǎo)致肝硬化患者，病毒除導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死誘發(fā)炎癥因子大量產(chǎn)生，并且誘導(dǎo)受染肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等大量分泌IL－8，CXCR1作為IL－8受體，其可能參與乙肝慢性化及肝硬化疾病進(jìn)程。王健等［8］研究也提示HBV感染后肝硬化患者外周血CXCR1mRNA表達(dá)上調(diào)。推測(cè)CXCR1在參與HBV介導(dǎo)的致炎分子作用。通過控制HBV復(fù)制或阻斷CXCR1表達(dá)可使肝硬化患者炎性反應(yīng)減輕，阻止或延緩纖維化的發(fā)生。本研究結(jié)果也表明，在四氯化碳引發(fā)肝細(xì)胞損傷后，CXCR1的表達(dá)無論是基因水平還是蛋白水平均提高，并且隨著損害時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)進(jìn)一步增高，因而可以認(rèn)為其參與損傷后的修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致后期肝纖維化的發(fā)生。

綜上所述，當(dāng)肝臟受到損傷后，大鼠體內(nèi)的NF－κB和CXCR1無論是基因還是蛋白均增高，可見兩者都參與了大鼠的肝臟損傷保護(hù)或者加重肝纖維化，為進(jìn)一步揭示肝臟在損傷條件下的肝纖維化機(jī)制提供了積極的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為治療肝臟損傷所引起的一系列疾病提供了一種手段，為研究新型藥物治療肝損傷提供一定的理論依據(jù)。

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