子宮內(nèi)膜輕創(chuàng)術(shù)對(duì)子宮內(nèi)膜容受相關(guān)因子表達(dá)的影響＊

江蘇省常州市婦幼保健院生殖中心（常州213003） 黃曉陽 陳 莉 楊海燕 許培箴 邢寶玲

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，即子宮內(nèi)膜處于一種允許胚胎粘附，穿透并使胚胎間質(zhì)發(fā)生改變從而使胚胎著床的狀態(tài)，直接影響胚胎能否種植成功［1］，是一個(gè)涉及到胚胎組織和子宮內(nèi)膜之間多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的復(fù)雜多階段的過程。目前IVF著床失敗病例中有三分之二是因?yàn)樽訉m內(nèi)膜容受性的原因［2］。近年來如何改善子宮內(nèi)膜容受性已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，其中包括子宮內(nèi)膜輕創(chuàng)術(shù)［3］，但是其作用機(jī)理尚不清楚，什么時(shí)間進(jìn)行輕創(chuàng)是最佳時(shí)機(jī)也無定論。本研究通過電子顯微鏡和分子生物學(xué)方法觀察輕創(chuàng)前后及不同時(shí)間輕創(chuàng)后著床期子宮內(nèi)膜胞飲突、整合素β3、同源框基因（HOXA－10）表達(dá)的變化，以探討輕創(chuàng)術(shù)對(duì)提高子宮內(nèi)膜容受性的作用及在月經(jīng)早卵泡期、中卵泡期和晚卵泡進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)的差異。

資料與方法

1 一般資料 選擇2010年1月至2011年10月，我院行IVF不孕患者90例，均簽署有關(guān)知情同意書。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡22～38歲；有規(guī)律排卵；不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩?，男方因素，且?jīng)宮腔鏡或子宮輸卵管碘油造影排除子宮因素，無子宮內(nèi)膜息肉；助孕周期前3個(gè)月內(nèi)未口服避孕藥或放置宮內(nèi)節(jié)育器；助孕周期前1年內(nèi)無流產(chǎn)、分娩、診刮或盆腔感染；既往有過一次宮內(nèi)妊娠，全部患者婦科檢查無陰道炎癥，無結(jié)核病史。90例隨機(jī)分為3組：A組（30例）：月經(jīng)第3天對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行行輕創(chuàng)術(shù)，B組（30例）：月經(jīng)第7天對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)，C組（30例）：月經(jīng)第11天對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)，所有患者均在輕創(chuàng)前1周期和輕創(chuàng)周期排卵后7d行子宮內(nèi)膜微活檢術(shù)獲取子宮內(nèi)膜。3組臨床相關(guān)數(shù)據(jù)比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），見表1。

表1 3組輕創(chuàng)組臨床相關(guān)數(shù)據(jù)（±s，n＝30）

表1 3組輕創(chuàng)組臨床相關(guān)數(shù)據(jù)（±s，n＝30）

31．2±2．1 32．5±1．9 31．9±1．5不孕原因輸卵管 18（60%） 16（53．33%） 15（50%）男性 10（33．33%） 12（40%） 10（33．33%）其它 2（6．67%） 2（6．67%） 5（16．6%）不孕時(shí)間（年） 4．2±1．2 5．1±1．3 4．8±1．6排卵日內(nèi)膜厚度（mm）A B C年齡指 標(biāo)10．1±1．5 11．4±1．6 10．5±1．7

2 方 法 ①子宮內(nèi)膜輕創(chuàng)術(shù)：常規(guī)消毒鋪巾，在B超引導(dǎo)下，由專人用特小號(hào)刮匙表淺地搔刮宮腔各面。②子宮內(nèi)膜微活檢術(shù)：排卵后7d，常規(guī)消毒鋪巾，用直徑3mm的宮腔組織吸引管（立可靈）進(jìn)入宮腔底部，向外抽內(nèi)芯，利用其負(fù)壓作用，自宮腔底部及宮壁多處取得微量?jī)?nèi)膜組織待用。③卵泡超聲檢查：采用B型超聲診斷儀（ALOKA）進(jìn)行自然周期卵泡監(jiān)測(cè)，陰道探頭頻率7．5MHz，由專人操作，所有患者均于月經(jīng)第12天開始接受檢查，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡達(dá)到15mm，開始每天監(jiān)測(cè)B超，直至卵泡成熟及排卵。④將待用的每份新鮮子宮內(nèi)膜標(biāo)本用生理鹽水反復(fù)沖洗分為2份，1份放入4%戊二醛固定備做掃描電鏡觀察胞飲突，另一份放入4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，用作免疫組化檢測(cè)整合素β3、HOXA－10。

3 觀察項(xiàng)目 ①掃描電鏡胞飲突觀察：每份標(biāo)本由2人同時(shí)觀察20個(gè)視野，選取其中有代表性的5幀，按Nikas等的方法，計(jì)算內(nèi)膜表面被覆胞飲突面積的百分比，＜20%為較少，20%～50%為中等，＞50%為豐富，每例標(biāo)本的結(jié)果為5幀畫面的平均值。②免疫組化檢測(cè)：采用SP法檢測(cè)整合素β3、HOXA－10蛋白在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，免疫組化的方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。兔單克隆抗體整合素β3為宜百康生物科技股份有限公司產(chǎn)品，兔多克隆抗體HOXA－10為上海玉博生物科技有限公司產(chǎn)品，根據(jù)Watanabe免疫組化半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，高倍鏡下連續(xù)觀察5個(gè)視野（200倍），視野里棕黃色顆粒為陽性著色，按細(xì)胞比率和染色的強(qiáng)度分為5個(gè)級(jí)別：陽性細(xì)胞＜5%，未被染色為陰性（－），計(jì)為0分；陽性細(xì)胞5%～15%，呈淺棕色為弱陽性（±），計(jì)為1分；陽性細(xì)胞15%～30%，棕色為陽性（＋），計(jì)為2分；陽性細(xì)胞30%～50%，深棕色為陽性（2＋），計(jì)為3分；陽性細(xì)胞＞50%，棕褐色為強(qiáng)陽性（3＋），計(jì)為4分。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包分析結(jié)果，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胞飲突、整合素β3、HOXA－10結(jié)果 見表2，圖1～2。術(shù)后胞飲突表達(dá)較術(shù)前更為豐富，整合素β3，HOXA10表達(dá)較術(shù)前增強(qiáng)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。掃描電鏡：所有子宮內(nèi)膜標(biāo)本都可以發(fā)現(xiàn)胞飲突的陽性表達(dá)，位于面向子宮宮腔的上皮細(xì)胞頂端膜表面，發(fā)育完全的胞飲突大小一致，邊界清楚，其表面的微絨毛消失而變得光滑，呈蘑菇樣外觀。但術(shù)前多為發(fā)育中胞飲突，發(fā)育完全胞飲突所占比例較少；輕創(chuàng)術(shù)后胞飲突發(fā)育更為完全，微絨毛少，表面光滑。免疫組化觀察結(jié)果：子宮內(nèi)膜免疫組化結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下觀察可見，輕創(chuàng)術(shù)前腺體少，血管少，腺腔內(nèi)無分泌物，間質(zhì)致密，內(nèi)膜腺體與間質(zhì)發(fā)育不同步，輕創(chuàng)術(shù)后腺體明顯增多，血管充盈明顯，腺體發(fā)育與間質(zhì)同步。整合素β3表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞膜和胞漿上；HOXA10表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞核中，輕創(chuàng)術(shù)后兩者的表達(dá)均比輕創(chuàng)術(shù)前有明顯地增強(qiáng)（P＜0．05）。

表2 輕創(chuàng)術(shù)前后子宮內(nèi)膜胞飲突、整合素β3、HOXA10表達(dá)自身對(duì)照（n＝90）

圖1 輕創(chuàng)術(shù)前后子宮內(nèi)膜整合素β3表達(dá)（免疫組化SP法×400）

圖2 輕創(chuàng)術(shù)前后子宮內(nèi)膜HOXA－10表達(dá)（免疫組化SP法×400）

2 不同時(shí)間輕創(chuàng)術(shù)后子宮內(nèi)膜胞飲突、整合素β3、HOXA10表達(dá)比較 見表3～4。輕創(chuàng)術(shù)前3組胞飲突，整合素β3，HOXA10表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；術(shù)后A組三者的表達(dá)明顯高于B組和C組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）

表3 3組輕創(chuàng)術(shù)前胞飲突、整合素β3、HOXA10表達(dá)的比較（n＝30）

表4 3組輕創(chuàng)術(shù)后胞飲突、整合素β3、HOXA10表達(dá)的比較（n＝30）

討 論

1 輕創(chuàng)術(shù)對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響 子宮內(nèi)膜容受性可以從形態(tài)學(xué)，超聲學(xué)及分子生物學(xué)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。在子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)方面，胞飲突作為子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)已經(jīng)被眾多學(xué)者證實(shí)，它是植入窗口期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞頂端出現(xiàn)的大而平滑的胞狀突起，有研究組已證實(shí)胚胎均著床在出現(xiàn)胞飲突的區(qū)域，并粘附在有胞飲突細(xì)胞的頂端［4］，胞飲突在人類子宮內(nèi)膜中出現(xiàn)在月經(jīng)的第20～21d，持續(xù)時(shí)間非常短暫，大約在48h后消退，而這一時(shí)期正好與胚胎著床的窗口期相吻合［5］。本研究中取的均是排卵后一周的子宮內(nèi)膜標(biāo)本，正好是子宮內(nèi)膜著床的窗口期，電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)所有的標(biāo)本中均有胞飲突出現(xiàn)，只是其分布和發(fā)育程度有差異。整合素β3和HOXA10是近幾年研究比較多的與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的因子。整合素β3是一類細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，屬于粘附分子超家族，由αβ兩個(gè)亞單位組成，介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附和信息傳導(dǎo)。其中整合素β3表達(dá)于黃體中期的子宮內(nèi)膜，與子宮內(nèi)膜植入窗的開放同步［6－7］。HOXA屬于多基因家族，是胚胎組織形態(tài)的主要調(diào)控基因，其中對(duì)胚胎著床影響最大的是HOXA10基因，屬于腹部B組HOX基因，染色體定位于7p15～p14．2，mRNA全長(zhǎng)2691bp，編碼785個(gè)氨基酸，是子宮內(nèi)膜著床調(diào)控必不可少的基因［8］。HOXA10蛋白在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)僅限于腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞中，隨著月經(jīng)周期的變化出現(xiàn)周期性，在著床窗口期的表達(dá)明顯上升，與血液中孕酮值升高一致［9］。并且最近研究發(fā)現(xiàn)，HOXA10通過和一個(gè)含41bp的調(diào)控元件的結(jié)合直接上調(diào)整合素β3的表達(dá)，HOXA10與整合素β3表達(dá)峰值時(shí)相一致［10］。本研究中，以患者輕創(chuàng)前后作自身對(duì)照，消除組間影響因素，較為客觀。結(jié)果顯示，輕創(chuàng)術(shù)后胞飲突，整合素β3，HOXA10表達(dá)比術(shù)前明顯增強(qiáng)，說明清創(chuàng)術(shù)可以提高這三者的表達(dá)，而這三種因子與子宮內(nèi)膜容受性有密切的聯(lián)系，進(jìn)一步證實(shí)了輕創(chuàng)術(shù)可以提高子宮內(nèi)膜的容受性。

2 輕創(chuàng)術(shù)對(duì)提高子宮內(nèi)膜容受性作用的機(jī)制 子宮內(nèi)膜輕創(chuàng)術(shù)可以刺激子宮內(nèi)膜，提高子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制不明。早在1907年，有報(bào)道對(duì)準(zhǔn)備受孕的豚鼠的子宮內(nèi)膜進(jìn)行搔刮，可刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞的快速生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其蛻膜化［11］。有大鼠試驗(yàn)證實(shí)子宮內(nèi)膜局部機(jī)械損傷可以使子宮內(nèi)膜組胺釋放增加，繼而誘導(dǎo)內(nèi)膜蛻膜化［12］。通過本研究結(jié)果，我們推測(cè)子宮內(nèi)膜輕創(chuàng)術(shù)是一種機(jī)械刺激，可清除不規(guī)則增生組織，促進(jìn)子宮內(nèi)膜小動(dòng)脈生成，改善子宮內(nèi)膜局部血供，從而增加子宮內(nèi)膜的容受性，并且輕創(chuàng)術(shù)后，著床相關(guān)因子表達(dá)明顯增加，可以提高胚胎著床的機(jī)會(huì)。

3 行輕創(chuàng)術(shù)的時(shí)間、方法和可行性 目前，臨床對(duì)胚胎移植中進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)可以改善子宮內(nèi)膜容受性已有一定的認(rèn)識(shí)，但是在什么時(shí)間進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)沒有達(dá)成共識(shí)。本研究將輕創(chuàng)術(shù)分為在早卵泡期，中卵泡期和晚卵泡期進(jìn)行，研究在不同時(shí)期進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)后著床相關(guān)因子的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在早卵泡期組進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)后著床相關(guān)因子表達(dá)最強(qiáng)，提示有可能在早卵泡期進(jìn)行輕創(chuàng)最有利于子宮內(nèi)膜容受性的改善。在早卵泡期進(jìn)行搔刮，有利于子宮內(nèi)膜的修復(fù)和同步化，而且輕創(chuàng)術(shù)用特小號(hào)刮匙，均在B超引導(dǎo)下進(jìn)行，動(dòng)作輕柔，宮腔各壁都有刺激，最小力度最大范圍地對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行刺激，在嚴(yán)格無菌操作下無一例發(fā)生感染，研究證實(shí)這種輕創(chuàng)是有效和安全的，具有一定的可行性。由于本研究樣本量小，對(duì)于在什么時(shí)間進(jìn)行輕創(chuàng)術(shù)是最佳時(shí)機(jī)，尚需要更加深入，細(xì)致和全面大樣本的研究。

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