射頻磁控濺射法制備鈦基HA 涂層的結(jié)構(gòu)與生物活性

王國卿,張乃生

(1.東北大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院,沈陽 110004；2.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,長春 130062)

鈦(Ti)因具有低密度、高強(qiáng)度、耐腐蝕等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域,但其性質(zhì)與骨組織相差很大,不能與骨組織發(fā)生化學(xué)鍵性結(jié)合[1]。因此,需要對Ti進(jìn)行表面改性,以增強(qiáng)其骨引導(dǎo)功能。羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)與人骨無機(jī)成分相似,可與細(xì)胞表面的生物大分子以氫鍵結(jié)合,是公認(rèn)的具有良好生物相容性和成骨活性的陶瓷材料[2],在醫(yī)用金屬材料表面改性方面應(yīng)用較多。Ti 基HA 涂層生物材料可將Ti的高力學(xué)強(qiáng)度和HA的優(yōu)良生物學(xué)性能相結(jié)合,在修復(fù)骨缺損中前景廣闊[3]。

制備HA 涂層的常用方法有溶膠–凝膠法[4]、等離子噴涂法[5]、電泳沉積法[6]、微弧氧化法[7]等。高溫下制備的HA 涂層存在微裂紋及CaO和α-磷酸鈣[8],涂層溶解率高,在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定性差；低溫生成的HA 涂層結(jié)合強(qiáng)度低,植入后存在涂層過早剝離的風(fēng)險。解決基體向涂層過渡的界面問題和獲得理想薄膜晶態(tài)是制備HA 涂層的關(guān)鍵。射頻磁控濺射法是制備金屬基陶瓷涂層的成熟技術(shù),具有基體溫升低、沉積快、涂層成分均勻、結(jié)合強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前以該技術(shù)制備金屬-HA 涂層生物材料的報(bào)道較少[10],且相關(guān)研究均缺乏生物材料在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)行為的反饋信息。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)是評價生物材料的常用方法,前者可以分析生物材料對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,對材料篩選具有重要意義；而機(jī)體環(huán)境及其與材料表面的相互作用過程十分復(fù)雜,因此生物材料在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)行為是準(zhǔn)確評價生物材料生物相容性的關(guān)鍵[11]?；趯ο嗳輻l件及有效表征的控制,更好地優(yōu)化射頻磁控濺射工藝,制備高質(zhì)量HA 涂層是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

為此,本文作者采用射頻磁控濺射法制備Ti 基HA 涂層生物材料,研究射頻磁控濺射沉積HA 涂層工藝、以及涂層的化學(xué)組成、微觀形貌與界面結(jié)合狀態(tài),以植入機(jī)體反饋評價生物材料的生物活性,探討射頻磁控濺射法制備HA 涂層在骨修復(fù)中應(yīng)用的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)基體為醫(yī)用TA2 純Ti 片,尺寸為10 mm×10 mm×2 mm。Ti 片表面用A12O3噴砂處理,經(jīng)30%HNO3酸洗30 min,然后在丙酮和無水乙醇溶液中超聲清洗各10 min,最后用去離子水漂洗、烘干。將平均粒徑20 nm的HA 粉體(南京埃普瑞納米材料有限公司生產(chǎn))與聚乙烯醇和水按10:1:1的質(zhì)量比混勻,于70 MPa 壓力下壓成直徑 60 mm、厚度30 mm的靶材,于真空爐中1100℃下燒結(jié)2 h,升溫速率3℃/min。

1.2 Ti 基HA 涂層制備

采用JPG560CI型超高真空多靶磁控濺射儀制備Ti 基HA 涂層。前期探索最適宜條件為：背底真空度5×10?4Pa,高純Ar 工作氣壓0.3 Pa,濺射功率290 W,靶–基間距50 mm,濺射時間1.5～6 h。將制得的Ti 基HA 涂層材料在空氣條件下以6℃/min的升溫速率升至600℃,保溫2 h后隨爐冷卻至室溫。

1.3 測試與表征

采用JSM-7500FA 掃描電鏡(JEOL Ltd 生產(chǎn))觀察涂層的表面形貌；利用XRD 分析涂層的相組成；用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)分析化學(xué)組成；采用維氏納米硬度計(jì)(CSEM Instruments)以納米壓痕法測試涂層的硬度,壓頭前端半徑20μm,運(yùn)動速度7 mm/min、加載速率2 N/min,最大載荷2 N。參照ASTM C-633,利用Instnon 1185 萬能材料試驗(yàn)機(jī)測試基體和涂層的界面結(jié)合強(qiáng)度[10]。

1.4 Ti 基HA 涂層材料的細(xì)胞相容性

按照李曉峰等[12]的方法分離鑒定大鼠成骨細(xì)胞,將第3 代細(xì)胞制成1×105/mL的細(xì)胞懸液。按上述方法制備直徑15 mm、厚2 mm的Ti 基HA 涂層試樣,經(jīng)60Co 輻射滅菌后置于24 孔培養(yǎng)板內(nèi),按1 mL/孔接種細(xì)胞于試樣表面,補(bǔ)足含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),對照組的孔內(nèi)不加任何材料。一部分于1 h后終止培養(yǎng),用PBS漂洗3 次,加入2.5%戊二醛固定,用掃描電鏡觀察細(xì)胞態(tài)；其余部分用于四氮噻唑鹽(MTT)比色法檢測材料細(xì)胞毒性：分別于2、5、8、11 天后取出培養(yǎng)板,加MTT 溶液20μL/孔,37℃下孵育4 h,棄上清,加入DMSO 220μL/孔,振蕩10 min 使結(jié)晶充分溶解。從每孔中取200μL 液體到96 孔板內(nèi),用酶標(biāo)儀490 nm測定各孔的吸光值(optical density,OD),以時間為橫坐標(biāo),OD為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線,根據(jù)細(xì)胞生長情況判斷Ti 基HA 涂層試樣的細(xì)胞毒性。

1.5 Ti 基HA 涂層在動物體內(nèi)的生物學(xué)行為

以10 只1.5～3 歲、體質(zhì)量8～11 kg的雜種犬為實(shí)驗(yàn)犬,肌注隆鵬麻醉,按照常規(guī)手術(shù)方法分離橈骨中段,制成10 mm×10 mm 尺寸的骨缺損,植入并固定Ti 基HA 涂層試樣,閉合創(chuàng)口,精心護(hù)理。術(shù)后4 周、12 周,將植入材料連同周圍新生骨組織取出,種植體骨結(jié)合界面進(jìn)行組織學(xué)切片,觀察骨組織生成的特征,檢測涂層的結(jié)合強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA 涂層形貌

圖1所示為HA 涂層表面和截面的SEM 形貌。由圖可見HA 涂層表面均勻,致密；檢測區(qū)域未見缺 損、裂縫和斷面；涂層表面凹凸不平,基本形狀為島嶼樣圓頂形顆粒,這種結(jié)構(gòu)大幅度增加了涂層的表面積。涂層與Ti 基體界面結(jié)合緊密,無氣孔和裂紋,基體與涂層界面處形成良好的機(jī)械咬合。在本實(shí)驗(yàn)條件下,涂層生成速率為0.54μm/h,隨濺射時間延長涂層厚度增加,獲得厚度(0.520±0.025)～(2.560±0.037)μm的涂層。不同厚度涂層的粗糙度如圖2所示,可見隨涂層厚度增加,涂層粗糙度Ra與Rz均略有增加。粗糙的表面有利于細(xì)胞的吸附、鋪展,為新骨組織生長提供條件。

圖1 HA 涂層表面(a)與截面(b)形貌Fig.1 The SEM photographs of HA coating

2.2 HA 涂層的XRD、IR 分析

圖3和圖4所示分別為HA 涂層的XRD譜和紅外光譜。從圖3可以看出：譜線中具有25.8°(002)、31.8°(211)、32.2°(112)HA 晶體特征峰,未見其它的鈣磷化合物及CaO的衍射峰,涂層的平均晶粒尺寸為(40±2)nm。圖4中除PO43?基團(tuán)特征振動峰外,還可見3570.05 cm?1對應(yīng)的OH?振動峰。因此,對射頻磁控濺射法制備的HA 涂層在大氣條件下進(jìn)行600℃下2 h的后處理,不僅可提高涂層的晶化程度,還利于晶格中OH?的恢復(fù)和穩(wěn)定存在,促使HA 晶體結(jié)構(gòu)完整。涂層中HA 結(jié)晶程度較高時其抗溶解性好,因而具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性[13]。

圖2 涂層厚度與粗糙度的關(guān)系Fig.2 The relationships between roughness and thickness of HA coatings

圖3 HA 涂層的XRD譜Fig.3 XRD pattern of HA coating

圖4 HA 涂層的紅外光譜Fig.4 IR analysis result of HA coating

2.3 HA 涂層的力學(xué)性能

納米壓痕法可測量材料的彈性模量和納米硬度等力學(xué)性能。Oliver和Pharr[14]完善了深度測量壓入法的測試原理,對于Berkovich 壓頭,涂層的納米硬度(H)和彈性模量(E)可由下列公式聯(lián)立求得：

式中：Pmax為最大載荷；hp為壓入深度；υi和Ei分別為壓頭的泊松比和彈性模量；υf和Ef分別為涂層的泊松比和彈性模量。

圖5所示為不同厚度的HA 涂層的力學(xué)性能?？梢姾穸葹?.0～1.6μm的涂層力學(xué)性能最好,其納米硬度高于11 GPa,彈性模量高于136 GPa。

圖5 HA 涂層的納米硬度和彈性模量隨涂層厚度的變化關(guān)系Fig.5 Nanohardness (H)and elastic modulus (E)of HA coatings as a function of the coating thickness

2.4 細(xì)胞相容性

圖6所示為HA 涂層表面成骨細(xì)胞的SEM 形貌。成骨細(xì)胞在HA 涂層表面粘附并伸展生長,在涂層凹陷處(見圖6(a)),成骨細(xì)胞呈圓形或橢圓形吸附于凹陷處,細(xì)長偽足伸向外側(cè)；在相對平坦的涂層表面,細(xì)胞拉長,偽足吸附于涂層表面或深入涂層間隙(如圖6(b)所示)。細(xì)胞偽足是細(xì)胞鋪展和遷移等行為的基礎(chǔ)[15],偽足形成說明涂層可為骨細(xì)胞的伸展生長提供必要的外部環(huán)境,利于新骨生成。

圖6 HA 涂層表面成骨細(xì)胞的SEM 形貌Fig.6 The SEM photographs of osteoblasts on the surface of HA coating

圖7所示為HA涂層材料對成骨細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組和對照組中成骨細(xì)胞增殖隨時間延長呈上升趨勢,5、8、11 天后實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞增殖顯著優(yōu)于對照組(P＜0.05),說明HA的細(xì)胞相容性優(yōu)于聚苯乙烯材質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)板。新生鼠成骨細(xì)胞部分保留了胚胎細(xì)胞分化表型,在骨組織工程研究中應(yīng)用較多[16]。成骨細(xì)胞可分泌骨基質(zhì)并使之礦化,成骨細(xì)胞本身被包圍在礦化的骨基質(zhì)中,形成骨細(xì)胞?？梢姵晒羌?xì)胞在生物材料上是否有增殖活力,是影響骨整合的重要因素。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)HA 涂層材料對成骨細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性,但機(jī)體內(nèi)環(huán)境十分復(fù)雜,還須用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 植入實(shí)驗(yàn)

圖7 HA 涂層材料對成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effect of HA coating material on osteoblast proliferation (P<0.05)

圖8 植入HA 涂層材料的組織學(xué)特征Fig.8 Histologic features of material surface implanted in HA/CS coating (Hematoxylin-eosin staining)

圖8所示為HA 涂層材料植入犬體內(nèi)4 周和12周后的組織學(xué)特征。可見HA 涂層材料植入4 周后,表面被新生的結(jié)締組織覆蓋,其顏色、結(jié)構(gòu)與正常骨無明顯差異,可見微血管形成,未見炎性細(xì)胞浸潤。植入12 周后,在骨小梁中可見破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞相互依賴、相互制約,共同完成骨的代謝活動。種植體表面出現(xiàn)破骨細(xì)胞,以形成利于成骨細(xì)胞骨生成活動的微環(huán)境[17]；此外,破骨細(xì)胞介導(dǎo)植入體周圍發(fā)生骨吸收,對于骨重建具有不可替代的作用,直接影響種植體成功或失敗[18?19]。本研究采用的1.6μm 厚HA 涂層與Ti 基體的結(jié)合強(qiáng)度在植入前為(41.2±2.4)MPa,植入12 周后為(40.7±1.8)MPa,二者差異不大,說明HA 涂層在機(jī)體內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。以射頻磁控濺射法制備的HA 涂層與Ti 基體的結(jié)合強(qiáng)度高于等離子噴涂、電泳沉積等方法,能夠滿足植入需要。

3 結(jié)論

1)射頻磁控濺射法制備的鈦基HA生物涂層為粗糙的島嶼狀結(jié)構(gòu),HA 平均粒徑為(40±2)nm,對涂層進(jìn)行600℃下2 h的后處理有利于HA中OH?恢復(fù),并提高HA的結(jié)晶度。

2)厚度1.0～1.6μm的HA 涂層力學(xué)性能最好,其納米硬度高于11 GPa,彈性模量高于136 GPa。

3)HA 涂層具有良好的細(xì)胞相容性,成骨細(xì)胞可粘附于HA 涂層表面,形成偽足鋪展生長,促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

4)體內(nèi)植入4 周后,材料表面被新生的結(jié)締組織覆蓋,血管形成；植入12 周后,骨小梁形成,其內(nèi)部可見破骨細(xì)胞。植入前與植入12 周后相比,涂層與基底結(jié)合強(qiáng)度無顯著變化。

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