中國荷斯坦牛IL8基因SNP－233（G＞A）不同基因型的表達差異研究

陳仁金，王珍珍，楊章平，毛永江，冀德君，朱孝榮

（1.徐州醫(yī)學院實驗動物中心，江蘇 徐州 212004；2.徐州醫(yī)學院神經(jīng)生物學研究中心，江蘇 徐州 212004；3.揚州大學動科學院，江蘇 揚州 22500）

乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，在世界范圍內造成了巨大的經(jīng)濟損失，研究者嘗試許多方法用于控制這種復雜的疾病，包括改進牧場的管理、對干奶牛進行抗生素治療、注射疫苗和監(jiān)控臨床乳房炎等。隨著分子生物技術的發(fā)展，用生物技術手段來預防和控制乳房炎成為熱點之一。

IL－8自發(fā)現(xiàn)以來，成為在趨化性細胞因子中是一個比較活躍的研究領域，各種非特異性炎癥的病理發(fā)生過程中頻繁地有IL－8的參與，以及IL8基因易于受到外界的刺激而被激活，因此IL－8可能在炎癥、免疫反應和機體防御反應中具有廣泛的作用。對于IL－8在人類上研究較多［1－3］，而與奶牛疾病方面的研究最近幾年越來越受關注。IL－8易于受到外界的刺激而被激活，已研究證明IL－8蛋白和mRNA的表達與奶牛乳房炎有密切的聯(lián)系［4］。當牛乳房受感染后，IL－8能誘導宿主防御系統(tǒng)抵抗病菌的侵入，同時IL－8會大量聚集。IL8基因的表達量也顯著增加［5－7］。研究發(fā)現(xiàn)IL8基因－233（G＞A）和2789（A＞G）＆2862（T＞C）位點對SCS顯著相關；了探索該位點不同基因型個體在血液中的表達差異，對該位點形成的不同基因型個體熒光定量PCR分析。對IL8基因的抗病機理進行初步探索，為奶?？谷榉垦仔誀詈蜻x基因的研究積累基礎分子數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取揚大牧場健康的中國荷斯坦牛30頭。胎次在2～3胎，處于泌乳中期。保證IL8基因各個基因型10頭。尾靜脈采血，ACD抗凝劑，新鮮血樣提取RNA，提取的RNA－70℃保存。

1.2 引物設計

根據(jù)用于熒光定量的目的基因IL8基因的mRNA序列（GenBank：NM＿173925）設計引物，內參基因β－actin引物根據(jù) mRNA序列（GenBank：AY141970）設計。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 RT－PCR

反應過程參照TaKaRa RNA AL PCRTMKit（AMV）反轉錄試劑盒使用說明，按步驟進行。將血液中總RNA作為模板在滅菌的0.2mL PCR離心管中依次加入以下組分的樣品。反轉錄體系為20 μL（反應液在冰上配制）：在0.2mL的PCR管中加入1μg的總RNA，Oligo dT Primer 1μL，5×PrimeScriptTMBuffer 4μL，Random primers 1μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1μL，加 RNase Free dH2O至總體積為20μL。將加好試劑的PCR管瞬時離心后放在PCR儀上進行反應。反轉錄條件如下：37℃15min（反轉錄反應）85℃5sec（反轉錄酶的失活反應）所得產(chǎn)物即為cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR

采用SYBR GreenⅠ染料法進行熒光定量，熒光定量PCR體系為20μL：

以上步驟均為冰上操作，每個樣本設三個重復。

熒光定量PCR擴增程序：95℃預變性1min；95℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸34s（data collection），40個循環(huán)；為分析擴增產(chǎn)物的特異性，PCR擴增結束后采集多個信息點進行溶解曲線分析，程序為：95℃ 15s，60 ℃ 1min；95 ℃ 15s，60℃15s。

1.5 統(tǒng)計軟件與方法

Primer Premier 5.0，SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件熒光定量計算采用2－△△CT方法［8］。

2 結果與分析

2.1 RNA的提取

RNA提取結果見圖1總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢出3條亮帶，從上到下分別為28s，18s和5s，說明提取的RNA完整性良好，無明顯降解，其OD260／OD280在1.8左右，純度較高，可用于后續(xù)的實驗。

2 結果與分析

2.2 IL8基因突變位點3種基因的相對定量表達分析

IL8基因－233（G＞A）位點的突變產(chǎn)生3種基因型。AA、AG和GG 3種基因型在血液中的熒光定量的△CT見表2，GG基因型的△CT極顯著低于AA和AG基因型（P＜0.01）。GG基因型的相對表達量極顯著高于AA和AG基因型（P＜0.05）（圖2）。

圖2 IL8基因－233（G＞A）位點不同基因型的表達量

表2 IL8基因－233（G＞A）位點不同基因型個體的△CT和RQ值

3 討論

IL8是一種重要的趨化因子，具有刺激中性粒細胞、淋巴細胞發(fā)生趨化游走，介導細胞在炎癥部位聚集、活化以及修復損傷的組織等功能［9］。然而，這些作用必須通過其與相應受體（interleukin－8receptor，IL8R，即CXCR）結合并借助信號轉導來實現(xiàn)［10］。在大腸桿菌感染引起的乳房炎的奶中，IL－8含量顯著增加［11，12］。在金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳房炎泌乳物中，能檢測到IL－8趨化活性，但在非乳房炎泌乳物中沒有此活性［13］。所以在乳房炎發(fā)生時，IL－8誘導激發(fā)中性粒細胞時起著重要的作用。

對于IL8基因的－233（G＞A）位點，GG基因型的表達量顯著高于其它兩種基因型（P＜0.05），所以GG基因型有較強的乳房炎抗性。233（G＞A）位點位于IL8基因的5′側翼區(qū)，該突變可能影響該基因表達調控，結果顯示，突變使該基因的表達量下降。對于其機理，需要進一步進行分析研究。

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