馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶新基因(Dd-FAD)的克隆與序列分析

邵 穎， 萬(wàn)景旺， 馮 輝， 朱 華， 程兆榜， 周益軍， 魏利輝

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014)

馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor Thorne)是墊刃目中一類重要的植物病原線蟲，在中國(guó)主要為害甘薯和馬鈴薯，此外還危害中藥材當(dāng)歸、薄荷和人參等［1-2］。目前，馬鈴薯腐爛莖線蟲病在中國(guó)北京、天津、山東、河北、河南、江蘇、浙江、福建、遼寧、甘肅等省市均有發(fā)生，已經(jīng)成為危害中國(guó)甘薯生產(chǎn)的重要病害。

脂肪酸去飽和酶存在于幾乎所有生物中，是催化多不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶類。尤其N-3系列和n-6系列多不飽和脂肪酸是細(xì)胞生物膜的重要組成成分，對(duì)生物膜的生化活性及維系細(xì)胞的生物學(xué)功能起著重要的調(diào)節(jié)作用［3］。

目前秀麗小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)共克隆得到7條脂肪酸去飽和酶基因，即FAT-1至FAT-7。FAT-5、FAT-6、FAT-7都編碼Δ-9脂肪酸去飽和酶，其中FAT-5編碼Δ-9脂肪酸去飽和酶可以催化軟脂酸變成棕櫚油酸，F(xiàn)AT-6和FAT-7所編碼Δ-9脂肪酸去飽和酶可以催化硬脂酸形成油酸。國(guó)內(nèi)外未見馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶的報(bào)道，本研究試圖克隆危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶基因，為今后對(duì)其基因功能分析提供科學(xué)依據(jù)，及為該病害的防控提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 線蟲材料與試劑

馬鈴薯腐爛莖線蟲為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所線蟲實(shí)驗(yàn)室收集、培養(yǎng)和保存的種群。培養(yǎng)和分離方法為:將線蟲消毒后接種于甘薯，培養(yǎng)1～2月出現(xiàn)病癥后將病薯切成小塊，采用淺盤法分離線蟲;浸泡48 h后移去篩盤，將底盤中的線蟲懸浮液通過(guò)500目(孔徑26 μm)篩收集線蟲。

TRIzol RNA提取試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司;5'及3'端SMARTer RACE試劑盒購(gòu)自Clontech公司;反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自Fermentas公司;pMD18-T載體、Ex Taq DNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司。

1.2 馬鈴薯腐爛莖線蟲總RNA提取及cDNA第一鏈合成

參照TRIzol(Invitrogen)使用說(shuō)明，提取樣品總 RNA。cDNA合成參照M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明。

1.3 馬鈴薯腐爛莖線蟲cDNA片段的同源克隆

以FA上游引物和下游引物為簡(jiǎn)并引物(表1)，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為:10×Buffer(含 Mg2+25 mmol/L)2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，模板 DNA 1.0 μl，Taq 酶 0.5 μl，加水補(bǔ)足25.0 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性4 min;94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。PCR產(chǎn)物于1.0% 瓊脂糖在電壓120 V條件下電泳20 min，用EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

表1 所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.4 3'端第一鏈cDNA的合成

用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA合成試劑盒合成 3'端第一鏈 cDNA，采用 10.00 μl體系:3.75 μl總RNA，1.00 μl 3'RACE CDS Primer A 混勻，72 ℃ 3 min，42℃ 2 min 溫育，然后加入 2.00 μl Buffer，1.00 μl DTT，1.00 μl dNTP，1.00 μl反轉(zhuǎn)錄酶，0.25 μl RNase 抑制劑，混勻后在42℃ 90 min，70℃ 10 min，加入150.00 μl EDTA稀釋。

1.5 3'RACE

以合成的3'端第一鏈cDNA為模板，以GSP-3上游引物1和RACE外側(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，72℃延伸3 min，5個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，68℃延伸30 s，72℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)采用 25.00 μl體系:2.50 μl 10 × PCR buffer，2.50 μl MgCl2，2.00 μl dNTP(2.5 mmol/L)，引物 GSP-3上游引物 1 和 RACE 外側(cè)引物(10 μmol/L)各 1.00 μl，0.25 μl Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)，1.00 μl第1 鏈cDNA，PCR級(jí)水補(bǔ)齊25.00 μl。再以PCR產(chǎn)物為模板，以GSP-3F2和RACE內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行巢式PCR，反應(yīng)條件為:94℃變性3 min;94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化目的片段，再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、PCR菌液檢測(cè)后測(cè)序。

1.6 5'端第一鏈cDNA的合成

采用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA合成試劑盒合成5'端第一鏈 cDNA，采用 10.00 μl體系:2.75 μl總RNA，1.00 μl 3'RACE CDS Primer A 混勻，72 ℃ 3 min，42℃ 2 min 溫育，然后加入 2.00 μl Buffer，1.00 μl DTT，1.00 μl dNTP，1.00 μl反轉(zhuǎn)錄酶，0.25 μl RNase 抑制劑，1.00 μl oligoⅡA，混勻后在42℃ 90 min，70℃ 10 min，加入100.00 μl EDTA稀釋。

1.7 5'RACE

以合成的5'端第一鏈cDNA為模板，以GSP-5下游引物1和RACE外側(cè)引物為引物，以GSP-5下游引物2和RACE內(nèi)側(cè)引物為引物，進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)條件與3'RACE相同。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化目的片段，再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、PCR菌液檢測(cè)后測(cè)序。

1.8 脂肪酸去飽和酶cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增

將cDNA序列拼接后，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異引物FAD上游引物和FAD下游引物進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增。PCR體系為:10 × Buffer(含 Mg2+25 mmol/L)2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，模板 DNA 1.0 μl，Taq 酶 0.5 μl，加水補(bǔ)足 25.0 μl。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃變性4 min;94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 2 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化目的片段，再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、PCR菌液檢測(cè)后測(cè)序。

1.9 脂肪酸去飽和酶cDNA序列分析

在 NCBI網(wǎng)站 (www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行基因Blastx同源比對(duì)分析，用軟件DNAMAN對(duì)基因cDNA序列進(jìn)行開放性閱讀框預(yù)測(cè)及其核苷酸序列翻譯，以軟件phylip臨近距離法構(gòu)建系統(tǒng)樹。以Compute pI/Mw(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量 (Mw)預(yù)測(cè)。使用在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/NetNGlyc/)對(duì)蛋白質(zhì)序列中可能存在的N糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯腐爛莖線蟲Dd-FAD cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析

使用簡(jiǎn)并引物FA上游引物和FA下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)到300 bp的cDNA條帶，對(duì)其進(jìn)行回收。經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)此片段與其他植物寄生線蟲部分序列高度同源，表明此cDNA片段為目的基因脂肪酸去飽和酶片段。用特異引物對(duì)目的基因3'和5'進(jìn)行RACE擴(kuò)增和測(cè)序，分別獲得660 bp片段和525 bp片段，利用DNASTAR軟件將擴(kuò)增和測(cè)序后的cDNA片段進(jìn)行拼接，獲得一個(gè)全長(zhǎng)為1 002 bp的cDNA序列。根據(jù)序列拼接結(jié)果，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)cDNA全長(zhǎng)序列。該基因cDNA全長(zhǎng)序列為1 183 bp，5'端起始密碼子ATG前有一段109 bp的非編碼區(qū)，3'端有一段72 bp的非編碼區(qū)，且3'端有多聚腺苷酸尾及加尾信號(hào)序列(AATAAA)，說(shuō)明克隆出來(lái)的是完整的cDNA序列，命名為Dd-FAD，GenBank登錄號(hào)為KF001837。

2.2 馬鈴薯腐爛莖線蟲Dd-FAD氨基酸序列分析

氨基酸序列分析結(jié)果顯示，馬鈴薯腐爛莖線蟲Dd-FAD基因由334個(gè)氨基酸組成。將Dd-FAD序列與線蟲綱已報(bào)道的脂肪酸去飽和酶蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并利用phylip軟件臨近距離法(Neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)在線工具預(yù)測(cè)，該氨基酸序列存在2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，它們分別是位于第252～255位的NISP和第291～294位的NFTK。該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量(Mw)為38 700，等電點(diǎn)(pI)為8.78。

BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Dd-FAD與Cr-FAD-5的序列相似性為72.00%，與Cb-FAD-6和Cab-FAD的序列相似性為59.00%。表明馬鈴薯腐爛莖線蟲的Dd-FAD為脂肪酸去飽和酶。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，Dd-FAD與Cab-FAD、Cb-FAD和Cr-FAD聚為一支，說(shuō)明它們親緣關(guān)系比較近。

3 討論

最近的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸去飽和酶在秀麗小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)抗寒過(guò)程中作用非常關(guān)鍵，尤其硬脂酰-CoA去飽和酶，該酶在與輔酶A相結(jié)合的飽和脂肪酸的Δ-9引入雙鍵形成單不飽和脂肪酸，在生物體內(nèi)的脂類代謝以及能量消耗過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Murray等研究發(fā)現(xiàn)，將秀麗小桿線蟲移到低溫時(shí)，脂肪酸去飽和酶FAD-7的轉(zhuǎn)率表達(dá)豐度迅速上升［4］;Brock等發(fā)現(xiàn)把秀麗小桿線蟲FAD-6和FAD-7基因同時(shí)沉默，突變體在－10℃低溫處理后，存活率低于1.00%［5］。Ladygina最早發(fā)現(xiàn)馬鈴薯腐爛莖線蟲在－28℃下可以存活。最新的研究發(fā)現(xiàn)該線蟲在－20℃條件下處理180 d存活率為49.01%，在－70℃條件下處理180 d后存活率仍達(dá)到19.21%［6］。目前脂肪酸去飽和酶基因在植物寄生線蟲中還未見報(bào)道，對(duì)其確切的生物學(xué)功能研究還不清楚。

本試驗(yàn)首次成功克隆出馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶Dd-FAD基因，該基因編碼334個(gè)氨基酸，與Cr-FAD的序列相似性為72.00%，與Cb-FAD和Cab-FAD的序列相似性為59.00%，由此確定我們克隆的基因?yàn)镕AD基因。該氨基酸序列存在2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，它們分別是位于第252～255位的NISP和第 291～294位的NFTK。該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量(Mw)為38 700，等電點(diǎn)(pI)為8.78。

在cDNA全長(zhǎng)克隆的基礎(chǔ)上，對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲脂肪酸去飽和酶蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，可以促進(jìn)人們對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲致病基因功能的了解。本試驗(yàn)分析了Dd-FAD序列并預(yù)測(cè)了其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，今后將對(duì)該基因蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分析并進(jìn)行RNA干擾。

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