波爾山羊黑素皮質(zhì)素受體4 C端基因單核苷酸多態(tài)性與體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析

張 俊， 錢 勇， 鐘 聲， 孟春花， 王慧利， 李隱俠， 曹少先

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物品種改良和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014)

黑素皮質(zhì)素受體4(Melanocortin receptor-4，MC4R)是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一種肽類物質(zhì)［1］，單一外顯子編碼，為G蛋白質(zhì)耦聯(lián)受體超家族成員之一。研究結(jié)果表明，MC4R基因的突變與人和動(dòng)物的生長、采食量、能量穩(wěn)態(tài)和脂肪沉積等性狀顯著相關(guān)［2-5］，可作為選擇動(dòng)物生長性狀的遺傳標(biāo)記。張菊等成功克隆了綿羊MC4R基因的cDNA序列［6］;張子軍等克隆了安徽白山羊MC4R基因的編碼區(qū)和部分 5'、3'非編碼區(qū)序列［7］，但關(guān)于山羊 MC4R 基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究對波爾山羊MC4R基因進(jìn)行了克隆和測序，尋找波爾山羊MC4R基因的多態(tài)性位點(diǎn)，分析其多態(tài)性與波爾山羊體重的關(guān)聯(lián)，為山羊生長性狀的分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

164只波爾山羊樣本由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，營養(yǎng)以及管理水平保持一致。波爾山羊各月齡的體重資料均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地提供。每個(gè)個(gè)體采集耳組織樣，置冰桶中帶回實(shí)驗(yàn)室，－20℃保存。

1.2 組織DNA提取

組織DNA提取采用酚-氯仿抽提法，TE Buffer溶解后－20℃保存。

1.3 MC4R 基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank:EU622853.2設(shè)計(jì)引物。上游引物序列:5'-TCCAAGTGATGCCGACCAG-3'，下游引物序列:5'-CTGGGCACTGCTTCACATC-3'。PCR反應(yīng)總體系 20.0 μl，含模板 DNA 60 ng，Taq 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 0.6 μl，MgC12(25 mmol/L)1.2 μl，10 ×緩沖液 2.0 μl，添加滅菌雙蒸水至 20.0 μl。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

1.4 克隆與測序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨機(jī)選取10只波爾山羊的PCR產(chǎn)物用TaKaRa膠回收試劑盒回收后與PMD-19T載體連接，16℃培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)16 h，挑選陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 突變位點(diǎn)篩選

將11個(gè)陽性克隆的測序結(jié)果與GenBank序列對比，確定突變位點(diǎn)。

1.6 PCR-RFLP 分析

1.6.1 目的基因擴(kuò)增 根據(jù)測序結(jié)果選擇MC4R C端基因片段2個(gè)突變位點(diǎn)(分別位于Ban II、Xsp I識別序列內(nèi))，設(shè)計(jì)2對引物(P1和P2)分別擴(kuò)增MC4R基因Ban II位點(diǎn)序列和Xsp I位點(diǎn)序列，引物序列見表1。

各引物 PCR 反應(yīng)總體系為 20.0 μl，含模板DNA60 ng，Taq 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 0.6 μl，MgC12(25 mmol/L)1.2 μl，10 × 緩沖液 2.0 μl，添加滅菌雙蒸水至20.0 μl。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，退火30 s(溫度見表1)，72℃延伸時(shí)間分別為15 s、8 s，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%、2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色檢測擴(kuò)增結(jié)果。

表1 波爾山羊MC4R基因PCR-RFLP分析選用的引物Table 1 The primers for PCR-RFLP analysis of MC4R gene in Boer goats

1.6.2 基因型的確定 采用限制性內(nèi)切酶Ban II、Xsp I分別對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系 16.0 μl，含 PCR 產(chǎn)物 4.0 μl、Ban II和 Xsp I(10 U/μl)各 0.5 μl、10 × 緩沖液 1.0 μl、滅菌雙蒸水10.5 μl。37℃酶切3 h。均用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，EB染色，培清JS-780全自動(dòng)凝膠成像分析儀進(jìn)行成像分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對不同基因型的體質(zhì)量采用SPSS軟件中的One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MC4R基因片段的擴(kuò)增結(jié)果

10只波爾山羊DNA模板分別進(jìn)行MC4R基因片段PCR擴(kuò)增，在1 400 bp左右得到一條特異性條帶(圖1)。

圖1 波爾山羊MC4R基因片段的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of MC4R gene in Boer goats

2.2 多態(tài)性位點(diǎn)的篩選

將10只波爾山羊DNA模板擴(kuò)增得到的MC4R基因片段克隆后進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank序列比對后發(fā)現(xiàn)MC4R C端基因片段存在2個(gè)點(diǎn)突變(圖2)，分別為編碼區(qū)946 bp處A與C單堿基顛換，986 bp處C與T單堿基顛換。經(jīng)分析A946C位點(diǎn)處于Ban II酶切位點(diǎn)內(nèi)，C986T位點(diǎn)處于Xsp I酶切位點(diǎn)內(nèi)。

圖2 波爾山羊MC4R基因突變位點(diǎn)測序結(jié)果Fig.2 The sequencing results of mutation loci of MC4R gene in Boer goats

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對164只波爾山羊樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2對引物都獲得了特異性良好的產(chǎn)物(圖3)，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度與預(yù)期結(jié)果一致。分別采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對2種PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，A946C位點(diǎn)經(jīng)Ban II消化出現(xiàn)2種基因型:AA(228 bp)、AC(59 bp、169 bp 和 228 bp)(圖4);C986T位點(diǎn)經(jīng)Xsp I消化出現(xiàn)3種基因型:CC(22 bp、130 bp)、CT(22 bp、130 bp 和 152 bp)、TT(152 bp)(圖 5)。

圖3 波爾山羊MC4R基因片段PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoresis patterns of MC4R gene fragment in Boer goats by PCR

圖4 波爾山羊MC4R基因片段Ban II酶切電泳圖Fig.4 Electrophoresis patterns of Boer goats MC4R gene digested with Ban II

圖5 波爾山羊MC4R基因片段Xsp I酶切電泳圖Fig.5 Electrophoresis patterns of Boer goats MC4R gene digested with Xsp I

2.4 MC4R基因多態(tài)位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)特性

由表2可見，A946C位點(diǎn)只檢測出2種基因型，C986T位點(diǎn)檢測出3種基因型。A946C位點(diǎn)AA型居多，占79.3%;AC型較少，占20.7%;A為優(yōu)勢基因。C986T位點(diǎn)CC型居多，占95.7%;CT型和TT型較少，分別占3.7%和0.6%;C為優(yōu)勢基因。A946C和C986T位點(diǎn)在波爾山羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC＜0.25)，而且群體遺傳雜合度較低，表明2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在波爾山羊群體中的遺傳一致性較高。

表2 A946C和C986T位點(diǎn)的基因型和基因頻率在波爾山羊群體中的分布Table 2 Distribution of gene and genotype frequency of loci A946C and C986T in Boer goats

2.5 不同基因型對波爾山羊體質(zhì)量的影響

MC4R基因A946C和C986T位點(diǎn)與波爾山羊體質(zhì)量的相關(guān)性分析見表3。結(jié)果顯示:在受檢的波爾山羊群體中，A946C位點(diǎn)2種基因型間各月齡波爾山羊體質(zhì)量差異均不顯著。C986T位點(diǎn)CT基因型個(gè)體的六月齡質(zhì)量和六月齡日增質(zhì)量均極顯著高于CC基因型，且CT基因型個(gè)體的周歲質(zhì)量和周歲日增質(zhì)量均顯著高于CC基因型，其他月齡體質(zhì)量和日增質(zhì)量差異均不顯著;TT基因型因只有一個(gè)個(gè)體，無法進(jìn)行差異顯著性分析，但TT型各月齡體質(zhì)量和日增質(zhì)量均高于其他基因型。

表3 MC4R基因A946C和A986C位點(diǎn)不同基因型的波爾山羊體質(zhì)量Table 3 Body weights of Boer goats in different genotypes of MC4R gene at loci A946C and A986C

同行同位點(diǎn)不同小寫字母表示差異達(dá)0.05顯著水平，同行同位點(diǎn)不同大寫字母表示差異達(dá)0.01極顯著水平。

3 討論

大量研究結(jié)果表明MC4R基因在動(dòng)物采食和能量平衡調(diào)控中起關(guān)鍵作用。MC4R基因敲除的小鼠表現(xiàn)出多食、肥胖、胰島素分泌過多等癥狀［3］，人MC4R基因突變可導(dǎo)致遺傳性肥胖。豬MC4R基因的Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度和采食量顯著相關(guān)［8］，兔 MC4R基因237 bp處 A/G突變顯著影響兔體質(zhì)量、全凈膛質(zhì)量以及飼料轉(zhuǎn)化率［9］。雞MC4R基因5'調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)上的4個(gè)突變位點(diǎn)對雞的體質(zhì)量、屠體性狀有顯著影響［10］。肉牛MC4R基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與其生長性狀和脂肪沉積顯著相關(guān)［11-13］。中國美利奴羊MC4R基因3'側(cè)翼區(qū)的3個(gè)突變位點(diǎn)對其體斜長和腰角寬有顯著影響［14］。但山羊MC4R基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析尚未見報(bào)道。

通過克隆測序，我們發(fā)現(xiàn)波爾山羊MC4R基因編碼區(qū)存在多個(gè) SNPs，其中位于編碼區(qū)末端的A946C和C986T位點(diǎn)分別導(dǎo)致I變成L(異亮氨酸→亮氨酸)和S變成F(絲氨酸→苯丙氨酸)。C端是MC4R錨定在質(zhì)膜所必須的，該段序列的缺失或者突變可能引起MC4R蛋白質(zhì)無法錨定到質(zhì)膜，從而使其無法與配體結(jié)合，導(dǎo)致功能缺失［15］。本試驗(yàn)通過PCR-RFLP方法檢測了A946C和C986T位點(diǎn)在波爾山羊中的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A946C位點(diǎn)檢測出2種基因型，C986T位點(diǎn)檢測出3種基因型。A946C位點(diǎn)AA型居多，AC型較少，A為優(yōu)勢基因。C986T位點(diǎn)CC型居多，CT型較少，TT型只檢測到1個(gè)樣本，C為優(yōu)勢基因。

本研究還分析了A946C和C986T位點(diǎn)不同基因型與波爾山羊群體各月齡體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，波爾山羊A946C位點(diǎn)2種基因型間各月齡體質(zhì)量差異均不顯著。C986T位點(diǎn)CT基因型個(gè)體的六月齡質(zhì)量和六月齡日增質(zhì)量均極顯著高于CC基因型，且CT基因型個(gè)體的周歲質(zhì)量和周歲日增質(zhì)量均顯著高于CC基因型，其他月齡體質(zhì)量和日增質(zhì)量差異不顯著;TT基因型各月齡體質(zhì)量和日增質(zhì)量均高于其他基因型，但TT基因型只有一個(gè)樣本，無法進(jìn)行差異顯著性分析。推測在C986T位點(diǎn)中，T基因?qū)ι窖蝮w質(zhì)量的增加更有利。綜上所述，MC4R基因C986T位點(diǎn)可以作為山羊體質(zhì)量性狀標(biāo)記輔助選擇的候選分子標(biāo)記。

［1］YEO G S H，F(xiàn)AROOQI I S，CHALLIS B G，et al.The role of melanocortin signalling in the control of body weight:evidence from human and murine genetic models［J］.QJM，2000，93(1):7-14.

［2］FAN W，BOSTON B A，KESTERSON R A，et al.Role of melanocortinergic neurons in feeding and the agouti obesity syndrome［J］.Nature，1997，385(6612):165-168.

［3］HUSZAR D，LYNCH C A，F(xiàn)AIRCHILD H V，et al.Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice［J］.Cell，1997，88(1):131-141.

［4］SRINIVASAN S，LUBRANO-BERTHELIER C，GOVAERTS C，et al.Constitutive activity of the melanocortin-4 receptor is maintained by its nterminal domain and plays a role in energy homeostasis in humans［J］.Journal of Clinical Investigation，2004，114(8):1158-1164.

［5］LOOS R J F，LINDGREN C M，LI S，et al.Common variants near MC4R are associated with fat mass，weight and risk of obesity［J］.Nature Genetics，2008，40(6):768-775.

［6］張 菊，杜立新，李宏濱，等.綿羊 MC4R基因的半定量 RTPCR及生物信息學(xué)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41(7):804-810.

［7］張子軍，程 蕭，劉洪瑜，等.山羊MC4R基因cDNA的克隆和序列分析及組織表達(dá)研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，40(12):20-26.

［8］KIM K S，LARSEN N，SHORT T，et al.A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits［J］.Mammalian Genome，2000，11(2):131-135.

［9］蔣美山，陳仕毅，賴松家，等.兔黑素皮質(zhì)素受體4(MC4R)基因多態(tài)性及其與體重及屠體性狀的關(guān)聯(lián)研究［J］.遺傳，2008，30(12):1574-1578.

［10］仇雪梅，李 寧，鄧學(xué)梅，等.雞 MC4R基因的 SNPs及其與屠體性狀的相關(guān)研究［J］.中國科學(xué):C輯，2006，36(2):127-133.

［11］ZHANG C L，WANG Y H，CHEN H，et al.Association between variants in the 5'-untranslated region of the bovine MC4R gene and two growth traits in Nanyang cattle［J］.Molecular Biology Reports，2009，36(7):1839-1843.

［12］LIU H，TIAN W，ZAN L，et al.Mutations of MC4R gene and its association with economic traits in Qinchuan cattle［J］.Molecular Biology Reports，2010，37(1):535-540.

［13］HUANG M，GAO X，LI J Y，et al.Polymorphisms in MC4R gene and correlations with economic traits in cattle［J］.Molecular Biology Reports，2010，37(8):3941-3944.

［14］曾獻(xiàn)存，陳韓英，賈 斌，等.MC4R和PROPl基因多態(tài)性及合并基因型與中國美利奴羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42(9):1227-1232.

［15］HO G，MACKENZIE R G.Functional characterization of mutations in melanocortin-4 receptor associated with human obesity［J］.Journal of Biological Chemistry，1999，274(50):35816-35822.