狼尾蕨體細(xì)胞耐鹽突變體篩選技術(shù)

葉曉青， 佘建明， 賈新平， 梁麗建， 尤 仙

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

蕨類植物又稱羊齒植物，是植物界中的一個(gè)大群。在植物分類中，蕨類植物屬于苔蘚植物和被子植物之間的一個(gè)過渡類型，是維管植物進(jìn)化過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蕨類植物的生活史由2個(gè)世代交替完成，即孢子體和配子體世代。2個(gè)世代都能獨(dú)立存活，這在植物界是獨(dú)一無二的。蕨類植物的繁殖方式分為有性繁殖(孢子繁殖)、無性繁殖(營(yíng)養(yǎng)繁殖)和組織培養(yǎng)，育種方法為引種馴化［1］。

自Nabors等［2］首次報(bào)道從煙草細(xì)胞系成功地篩選出耐鹽突變體再生植株之后，目前有關(guān)植物篩選耐鹽細(xì)胞系與變異體或突變體研究已有大量報(bào)道，涉及的植物種類超過40種。植物細(xì)胞進(jìn)行耐鹽突變體篩選，尚有待建立高效植株再生技術(shù)體系，克服耐鹽細(xì)胞系難以再生完整植株的障礙和提高耐鹽突變體檢測(cè)效果［3］。本研究以狼尾蕨無菌苗葉片為外植體材料，在建立離體培養(yǎng)植株再生技術(shù)的基礎(chǔ)上，探討不同濃度氯化鈉對(duì)葉片不定芽誘導(dǎo)能力的影響，試圖建立氯化鈉直接篩選法獲得耐鹽突變體再生植株的技術(shù)體系，并對(duì)體細(xì)胞突變體進(jìn)行與耐鹽性相關(guān)的分子檢測(cè)，為開展蕨類植物細(xì)胞工程育種技術(shù)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以狼尾蕨(Davallia bullata)無菌試管苗的葉片為外植體材料。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

基本培養(yǎng)基由MS大量元素、微量元素［4］和B5維生素［5］組成，添加蔗糖30 g/L，瓊脂條為8 g/L。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上附加1.0 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA，不定芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上附加0.5 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA，成苗和生根培養(yǎng)基在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上附加0.2 mg/L IBA。培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8。

狼尾蕨葉片誘導(dǎo)不定芽植株再生的培養(yǎng)方法詳見前期報(bào)道［6］。培養(yǎng)室溫度為(26±2)℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為16 h。

1.3 NaCl篩選方法

在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上加入 NaCl，NaCl濃度(質(zhì)量與體積比)分別為0(對(duì)照)、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%和0.8%。采用直接篩選法，培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。

不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)/接種的葉片總數(shù)×100%

1.4 與耐鹽性相關(guān)SSR分子標(biāo)記方法

基因組 DNA提取和檢測(cè):分別取0、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%NaCl濃度篩選得到的再生植株混合株的幼葉為材料，采用改良的CTAB方法提取基因組DNA?；静襟E如下:(1)取幼嫩葉片，加1%不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用液氮磨至粉狀;(2)加入600 μl十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)抽提緩沖液，混勻，65℃水浴1 h;(3)冷卻至室溫，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻;(4)10 000 r/min離心10 min;(5)吸上清液，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，上下?lián)u動(dòng)30 s，充分混合至能見到DNA絮狀物;(6)10 000 r/min離心1 min，倒掉液體;(7)加入300 μl含有RNA酶的TE緩沖液溶解DNA，37℃恒溫過夜;(8)加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，10 000 r/min離心10 min;(9)取上清液，加入 720 μl的75%乙醇及80 μl 5 mol/L醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使DNA塊狀物浮游于液體中;(10)放置30 min，10 000 r/min離心1 min，倒掉液體，再加入1 000 μl 70%的乙醇;(11)10 000 r/min離心 1 min，DNA沉淀自然風(fēng)干，加入50～100 μl的 TE緩沖液，使DNA溶解。經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)總體積為20.0 μl，含有 10 × PCR 緩沖液 2.0 μl，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，SSR 引物組合(10 μmol/L)1.0 μl，基因組 DNA(30 ng/μl)2.0 μl，Taq DNA 聚 合 酶 (2.5 U/μl)0.2 μl，ddH2O 11.3 μl。反應(yīng)在 MJ Research Thermal Cycler PTC-100PCR儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上恒壓(150～200 V)電泳1 h左右，參照快速銀染法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行銀染檢測(cè)［7］。

本試驗(yàn)所用的248個(gè)SSR分子標(biāo)記，均勻分布于整個(gè)基因組和適用于麥類作物擴(kuò)增的引物組合，包括248條正向引物和248條反向引物［8］。

2 結(jié)果

2.1 NaCl濃度對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

在附加NaCl的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上狼尾蕨葉片誘導(dǎo)不定芽結(jié)果顯示:隨著NaCl濃度的提高，接種的葉片褐化率逐步提高(圖1和圖2)，不定芽誘導(dǎo)率逐步下降。當(dāng) NaCl濃度為 0、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率分別為80.2%、28.4%、20.6%、15.9% 和 7.8%。NaCl濃度為0.8%時(shí)，葉片徹底喪失不定芽的誘導(dǎo)能力(表1)。

表1 NaCl濃度對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響Table 1 Effects of NaCl concentrations on the induction of adventitious bud from Davallia bullata leaves

圖1 在無NaCl培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的不定芽Fig.1 The adventitious buds induced from the leaves of Davallia bullata in NaCl-free medium

圖2 在0.6%NaCl培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的不定芽Fig.2 The adventitious buds induced from the leaves of Davallia bullata in 0.6%NaCl medium

0～0.4 %NaCl濃度為一敏感區(qū)，葉片誘導(dǎo)不定芽頻率從80.2%降至28.4%;0.6%～0.7%NaCl為另一敏感區(qū)，不定芽誘導(dǎo)率從15.9%降至7.8%。試驗(yàn)中觀察到葉片經(jīng)過NaCl篩選誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的時(shí)間推遲3～5 d。不定芽轉(zhuǎn)到無NaCl的增殖培養(yǎng)基上恢復(fù)正常生長(zhǎng)，在成苗和生根培養(yǎng)基上可以得到完整的再生植株(圖3)，其移栽成活率略低于對(duì)照。

圖3 0.6%NaCl篩選得到的再生植株Fig.3 The regenerated plantlets selected with 0.6%NaCl

與以通過愈傷組織分化再生植株途徑獲得的愈傷組織為外植體材料相比較，通過不定芽誘導(dǎo)再生植株途徑，以葉片為外植體材料NaCl篩選濃度總體上偏低，因此宜選用較高濃度的NaCl。以狼尾蕨無菌苗的葉片為外植體材料，0.6% ～0.7%NaCl是較為適宜的耐鹽突變體篩選濃度。

2.2 與體細(xì)胞突變體耐鹽性相關(guān)SSR標(biāo)記

在供試的248對(duì)引物組合中，有9對(duì)引物組合在野生型狼尾蕨和耐鹽突變體植株之間PCR擴(kuò)增存在多態(tài)(表2)。引物WXE-56在野生型狼尾蕨中可以擴(kuò)增出約1 500 bp和1 000 bp 2條特異性條帶，而在經(jīng)過0.4%、0.5%、0.6%和0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中均無法擴(kuò)增出以上特異性條帶;在經(jīng)過0.5%、0.6%和0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中均可以擴(kuò)增出約700 bp的特異性條帶，并且經(jīng)過0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中還可以擴(kuò)增出約600 bp的特異性條帶，而在野生型狼尾蕨中均缺少以上特異性擴(kuò)增條帶(圖4A)。引物WXE-204在野生型材料狼尾蕨中可以擴(kuò)增出約600 bp的特異性條帶，而在經(jīng)過0.5%、0.6%和0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中均無法擴(kuò)增出該特異性條帶;在經(jīng)過0.5%NaCl篩選獲得的突變體植株中可以擴(kuò)增出約1 000 bp特異性條帶，經(jīng)過0.6%NaCl篩選獲得的突變體植株中可以擴(kuò)增出約500 bp和400 bp的特異性條帶，經(jīng)過0.7%NaCl篩選獲得的突變體植株中可以擴(kuò)增出約420 bp和450 bp的2條特異性條帶，而在野生型材料狼尾蕨中均無法擴(kuò)增出以上特異性條帶(圖4B)。因此，WXE-56和WXE-204可用作狼尾蕨體細(xì)胞耐鹽突變體鑒定的適宜引物。

表2 SSR引物序列Table 2 Primer sequences used for SSR analysis

圖4 耐鹽性相關(guān)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of regenerated plantlet of D.bullata by SSR markers associated with salt tolerance

3 討論

愈傷組織是目前普通采用的植物突變體篩選的外植體材料［9-11］。耐鹽突變體篩選以NaCl為篩選劑，選擇方法為直接篩選和間接篩選2種方法。直接篩選法，即將愈傷組織直接置于高濃度NaCl(1.5% ～2.0%)的培養(yǎng)基上;間接篩選法，即從0.2%至2.5% 逐級(jí)提高NaCl濃度，將愈傷組織在每級(jí)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1代至數(shù)代，最終獲得不同抗鹽水平的變異素［12］。在植物體細(xì)胞培養(yǎng)中，就遺傳穩(wěn)定性而言，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，外植體材料通過誘導(dǎo)不定芽再生植株途徑比經(jīng)過愈傷組織脫分化再生植株途徑更為適宜。以狼尾蕨的葉片與其他植物的愈傷組織作為突變體篩選材料相比較，葉片對(duì)NaCl篩選濃度的反應(yīng)更為敏感。本試驗(yàn)中，狼尾蕨葉片在0.8%NaCl選擇下徹底喪失不定芽的誘導(dǎo)能力，因而認(rèn)為0.6% ～0.7%NaCl為適宜的篩選濃度。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記是基于PCR基礎(chǔ)上的第二代分子標(biāo)記，與其他分子標(biāo)記相比，具有呈共顯性、數(shù)量豐富、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好和結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)［13］。本試驗(yàn)在248對(duì)適用于麥類作物擴(kuò)增的引物組合中發(fā)現(xiàn)有9對(duì)引物在狼尾蕨野生型和耐鹽突變體植株之間PCR擴(kuò)增存在多態(tài)，表明SSR標(biāo)記方法適用于狼尾蕨體細(xì)胞耐鹽突變體分子鑒定。

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