瑟伯氏棉TIR-NBS-LRR類蛋白質編碼基因的克隆與分析

楊曉杰， 趙付安， 唐中杰， 李 武， 趙元明， 謝德意， 房衛(wèi)平

(1.河南省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，河南 鄭州 450002;2.棉花生物學國家重點實驗室，中國農業(yè)科學院棉花研究所，河南安陽455000)

棉花黃萎病是由真菌病原大麗輪枝菌(Verticilli-um dahliae)引起的維管束病害，曾給中國棉花生產(chǎn)造成了巨大的損失［1－4］。利用物理化學等手段防治黃萎病的效果均不特別理想［5］。而且，目前主栽品種陸地棉及海島棉對黃萎病菌抗性不強及大麗輪枝菌自身致病機理復雜等原因，造成棉花黃萎病尚未得到有效控制［6］。作為最大的抗病基因類別，編碼 TIR－NBSLRR類抗病蛋白質的R基因在保護植物免受病原菌侵害中起著十分重要的作用［7］。利用基因工程方法培育棉花抗黃萎病品種是控制棉花黃萎病的有效途徑［8］。對此，國內外學者對抗病基因在抗黃萎病中的作用做出了許多有益的探索。例如，趙磊等利用同源序列克隆策略從高抗黃萎病棉花品種KV－1中擴增具有抗病基因典型結構的抗病基因同原序列［9］，這無疑為克隆抗病基因奠定了基礎。并且在植物，特別是模式植物中NBS－LRR蛋白質與病原菌分泌的效應蛋白質的直接［10－11］或間接識別［12－13］、NBS－LRR 蛋白質的同源或異源［14－15］低聚體化及其亞細胞表達定位［16－17］等均取得了較大的進展。

目前，研究者已著手從抗病基因的相互作用關系來研究植物的抗病機制。例如，黃萎病菌誘導下陸地棉抗病品種的EST分析結果表明，當黃萎病菌侵染棉花后，植物體內發(fā)生了包括防御、次生代謝、脅迫及信號轉導等系列反應［18］;再者，對海島棉接菌誘導后根部差異表達蛋白質的分析結果同樣表明，海島棉在接菌后發(fā)生涉及初生及次生代謝等網(wǎng)絡式反應［19］。以上研究結果均暗示抗黃萎病是一個多途徑參與的復雜過程。最近，對陸地棉抗、感品種接菌后的 cDNA－AFLP分析結果表明，抗病品種 NJ0705的1個 TIRNBS－LRR類抗病蛋白質編碼基因在接菌后上調表達［20］;同樣，我們對野生瑟伯氏棉接菌前后差異表達蛋白質的質譜分析結果亦表明，接菌后，有 3個TIR－NBS－LRR類蛋白質點集中上調表達［21］，顯示TIR－NBS－LRR基因在瑟伯氏棉抗黃萎病中可能起主導作用。

因此，對棉花抗黃萎病育種而言，選擇抗黃萎病的野生棉種質資源，從中克隆NBS－LRR類抗病編碼基因，進而深入研究其在抗病信號轉導途徑中具體作用機制，無論是對植物R基因作用機制的詮釋，還是對實現(xiàn)棉花黃萎病的有效控制均尤為必要。本研究以抗黃萎病的瑟伯氏棉為材料，通過電子克隆等技術，對接菌試驗中上調表達的3個TIR－NBS－LRR類蛋白質點的編碼基因進行基因全長的克隆和分析，并對瑟伯氏棉的 TIR－NBSLRR類基因編碼蛋白質在抗病反應中的可能作用機制進行討論。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生棉瑟伯氏棉(G.thurberi Tod.)和戴維遜氏棉(G.davidsonii Kell.)種子由中國農業(yè)科學院棉花研究所提供。種子表面用0.1%升汞消毒液處理8 min，無菌水充分沖洗后，播種于無底紙缽內的培養(yǎng)土(建筑細沙∶蛭石=6∶4，事先高壓滅菌)中，于人工可控溫室(晝溫28℃，夜溫25℃，相對濕度60%)中發(fā)芽。

1.2 黃萎病菌

黃萎病大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)W菌株由河南農業(yè)大學植物保護學院提供。平板活化后，轉接到查彼氏培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)(200 r/min，25℃)10 d。經(jīng)4層滅菌紗布過濾，無菌水稀釋，制成1 ml 1.2×107個孢子的孢子懸液，備用。

1.3 接菌誘導

用一次性醫(yī)用注射針管取15 ml孢子菌液(或無菌水)分別注入各培養(yǎng)皿中，讓其自然吸入缽內，30 d后記錄、觀察對黃萎病菌的抗性表型。

1.4 RNA的提取及3'，5'RACE

總RNA提取按照天恩澤Column plant RNAout試劑盒說明書進行，cDNA第一鏈合成按照大連寶生物PrimescriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis kit說明書進行。Easy－A high－fidelity PCR cloning enzyme購自 Stratagene公司;cDNA 3'－full RACE core set試劑盒、cDNA 5'－full RACE core set 試劑盒、快速連接試劑盒、Taq DNA聚合酶以及限制性內切酶等常規(guī)生化試劑均購自大連寶生物工程公司。E.coli DH5α感受態(tài)細胞購自北京百泰克生物公司;pMD18－T克隆載體購自大連寶生物工程公司。凝膠回收試劑盒、反轉錄試劑盒購自Promega公司。

1.5 序列分析

數(shù)據(jù)庫搜索采用NCBI Blast搜索程序。利用DNAMAN軟件對DNA序列進行分析和組裝，利用Pf scan軟件對蛋白質功能域搜尋(http://hits.isbsib.ch/cgi－bin/PFSCAN)。

2 結果與分析

2.1 瑟伯氏棉抗性接種鑒定

以感病野生棉戴維遜氏棉為對照，于溫室中對兩種野生棉資源接種鑒定，接菌后1個月左右觀察抗性表型。接種鑒結果表明，瑟伯氏棉植株長勢正常良好，表現(xiàn)出對萎黃病W菌系的良好抗性，而對照戴維遜氏棉植株葉片脫落，逐漸死亡(圖1)。

圖1 瑟伯氏棉和戴維遜棉黃萎病抗性接菌鑒定Fig.1 Disease-resistance identification of G.thurberi and G.davidsonii inoculated with Verticillium dahliae

2.2 TIR－NBS－LRR類蛋白質編碼基因 GTHN1全長cDNA序列的獲得

根據(jù)基因GTHN1編碼區(qū)序列，分設計5'端和3'端 引 物 5'－TTAGTCTACCTAGTTGTACCAT－3'、5'－TCTCTGCAGGTAGTACAGGATTG－3'，分別與 5'、3'－full RACE core set試劑盒中的Outer及Inner引物組合，擴增GTHN1基因的5'端和3'端非編碼區(qū)。擴增產(chǎn)物經(jīng)測序、拼接后獲得完整的序列;進而根據(jù)全長 序 列 設 計 引 物 (F:5'－GAGATTGAGATATCCTTCTCC－3'及 R:F:5'－TACCTTAATCAAAGTTTAAT－3')對瑟伯氏棉基因組DNA進行擴增，得到預期1 984 bp的產(chǎn)物(圖2)。

圖2 瑟伯氏棉TIR-NBS-LRR基因GTHN1的RACE和PCR擴增Fig.2 Amplification of GTHN1 gene from G.thurberi by RACE and PCR

利用NCBI中的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)工具和本地計算機DNAman軟件，分析GTHN1基因的開放閱讀框，得到它們的預期編碼蛋白質的987個氨基酸序列(圖3)。GTHN2與GTHN3分別編碼 500和1 546個氨基酸(序列略)。GTHN1基因編碼氨基酸序列包含1個Toll蛋白質及白細胞介素－1受 體 (Toll－interleukin－1 receptor，TIR)結 構 域、1個核苷酸結合位點(Nucleotide binding site，NBS)結構域及1個富含亮氨酸重復序列(Leucine－rich repeat，LRR)。

2.3 TIR－NBS－LRR編碼基因比對與系統(tǒng)進化分析

3個基因全長的信息學分析結果表明，其氨基酸序列均包含1個Toll蛋白質及白細胞介素－1受體結構域、1個核苷酸結合位點結構域、1個富含亮氨酸重復序列(GTHN3無LRR功能域)及抗病基因保守的跨膜區(qū)GLPLA，其中NBS區(qū)包括典型的P－loop(Kinase－1a)、Kinase－2、Kinase－3 3 個基序(圖 4)。

圖4 瑟伯氏棉TIR-NBS-LRR蛋白氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of the deduced amino acid sequences of G.Thurberi TIR-NBS-LRR genes

同類基因系統(tǒng)進化分析結果表明，GTHN1、GTHN2和GTHN3 3個基因聚在一起，且與其他物種同類基因進化關系較遠。在11個確定的抗病基因中，親緣關系最近的是煙草的抗病毒N基因，其次是西紅柿的Bs4基因和亞麻的L6基因，而與擬南芥的RPP系列和CA1基因均較遠(圖5)。盡管親緣關系有遠近之別，以上基因均為典型的抗病基因，顯示GTHN1、GTHN2及GTHN3亦為抗病基因，并可能在瑟伯氏野生棉應對黃萎病菌脅迫中起重要作用。

圖5 不同植物TIR-NBS-LRR基因系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the TIR-NBS-LRR genes from different plant species

3 討論

迄今為止，大約70多個R基因已被克隆并鑒定［22］。目前，國內外研究主要集中在 TIR－NBS－LRR類抗病蛋白質各功能域的功能、抗病蛋白質編碼基因之間的互作、及抗病蛋白質與上下游信號分子的識別等方面［23－25］。LRR 結構域負責首先與無毒蛋白質的識別，并決定特異抗性。TIR結構域在啟動下游防御信號途徑中起主要作用［26］，且該結構域多在雙子葉植物中存在［27］，而單子葉植物中很少見［28］。該特點可能與雙子葉植物的特異抗性有關。NBS結構域存在于真核生物的許多蛋白質中，這些蛋白質對于細胞的生長、分化、細胞骨架的形成、小泡運輸和防御反應都有關鍵性的作用［29－30］。該特征顯示NBS結構域的功能十分廣泛。

有研究者指出，NBS－LRR類基因在植物基因組中呈多拷貝、且往往成簇存在［31］，這或許是植物產(chǎn)生應對不同病原物或同種病原物的不同小種特異抗性的遺傳基礎。有報道表明，眾多的NBS－LRR類基因在擬南芥中呈現(xiàn)低水平表達，并且其中一部分呈組織特異性表達模式。在病原菌誘導下，也只是為數(shù)不多的幾個NBS－LRR類基因呈現(xiàn)表達水平的改變，而剩余的絕大多數(shù)基因的表達水平并無變化［32］。以上報道顯示，植物在某一病原物侵染下，不是一個 NBS－LRR類基因，更不是其全部 NBSLRR類基因在起作用，而是針對該病原物的特定效應因子，植物中自身有選擇的幾個NBS－LRR類基因在協(xié)同發(fā)揮作用，進而誘導超敏反應。例如，番茄CC－NBS－LRR蛋白質是在感知其病原菌效應因子AvrPto之前就以低聚體復合物形式存在［33］;再如，四倍體和六倍體小麥對葉銹病的抗性則需要Lr10和 LGA2 兩個 CC－NBS－LRR 蛋白質的共同參與［34］。雖然 RRS1－Ws和 RPS4－Ws兩個 TIR－NBS－LRR 蛋白質具體互作機制尚不清楚，但兩者同時存在才賦予擬南芥對炭疽病菌的抗性［35］。

我們的研究結果亦表明，黃萎病菌W株系誘導瑟伯氏棉3個 TIR－NBS－LRR類抗病蛋白質點(雙向電泳差異點)集中高調表達。因而，結合上述文獻與本試驗結果，我們推測在瑟伯氏棉抗黃萎病機制中的TIR－NBS－LRR類抗病蛋白質感知病菌效應因子和啟動抗病轉導信號途徑這一最初環(huán)節(jié)是由幾個TIR－NBS－LRR類基因在協(xié)同起作用，共同感知黃萎病菌效應因子并啟動抗病信號轉導途徑。

［1］張 聽，簡桂良，林 玲，等.土壤中落葉型棉花黃萎病菌的分子檢測方法［J］.江蘇農業(yè)學報，2011，27(5):990－995.

［2］鄧 晟，章如意，林 玲，等.江蘇省大豐市棉花黃萎病菌培養(yǎng)特性及致病力分化［J］.江蘇農業(yè)科學，2012，40(12):133－135.

［3］薛 艷，袁洪波，陳天子，等.4個棉花品種對不同黃萎病菌的抗性差異比較［J］.江蘇農業(yè)科學，2012，40(10):94－96.

［4］李 鳳，耿雅文，孫健富，等.棉花黃萎病菌毒素誘導植株產(chǎn)生抗病性的機理［J］.江蘇農業(yè)科學，2012，40(8):102－105.

［5］馬 存.棉花枯萎病和黃萎病的研究［M］.北京:中國農業(yè)出版社，2007:253－270.

［6］簡桂良，齊放軍，張文蔚.棉花抗黃萎病品種選育策略的思考［C］.中國植物病理學會.中國植物病理學會學術年會論文集.北京:中國農業(yè)科學技術出版社，2010:536－542.

［7］MONDRAGON－PALOMINO M，MEYERS B C，MICHELMORE R W，et al.Patterns of positive selection in the complete NBS－LRR gene family of Arabidopsis thaliana［J］.Genome Res，2002(12):1305－1315.

［8］房衛(wèi)平，祝水金，季道藩.棉花黃萎病菌與抗黃萎病遺傳育種研究進展［J］.棉花學報，2001，13(2):116－120.

［9］趙 磊，王升正，齊放軍，等.棉花多抗品種中植棉KV－1抗病基因同源序列的克隆與分析［J］.棉花學報，2009，21(6):462－467.

［10］KRASILEVA K V，DAHLBECK D，STASKAWICZ B J.Activation of an Arabidopsis resistance protein is specified by the in planta association of its Leucine－rich repeat domain with the cognate Oomycete effector［J］.The Plant Cell，2010，22:2444－2458.

［11］CATANZARITI A M，DODDS P N，VE T，et al.The AvrM effector from Flax rust has a structured C－Terminal domain and interacts directly with the M resistance protein［J］.Mol Plant－Microbe Interact，2010，23(1):49－57.

［12］XING W，ZOU Y，LIU Q，et al.The structural basis for activation of plant immunity by bacterial effector protein AvrPto［J］.Nature，2007，449:243－247.

［13］CAPLAN J L，MAMILLAPALLI P，BURCH－SMITH T M，et al.Chloroplastic protein NRIP1 mediates innate immune receptor recognition of a viral effector［J］.Cell，2008，132:449－462.

［14］MESTRE P，BAULCOMBE D C.Elicitor－mediated oligomerization of the tobacco N disease resistance protein［J］.Plant Cell，2006，18:491－501.

［15］GUTIERREZ J R，BALMUTH A L，NTOUKAKIS V，et al.Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto－like kinases that diversify effector recognition［J］.The Plant Journal，2009，61:507－518.

［16］SLOOTWEG E，ROOSIEN J，SPIRIDON L N，et al.Nucleocytoplasmic distribution is required for activation of resistance by the potato NB－LRR receptor Rx1 and is balanced by its functional domains［J］.The Plant Cell，2010，22:4195－4215.

［17］TAMELING W I L，NOOIJEN C，LUDWIG N，et al.RanGAP2 mediates nucleocytoplasmic partitioning of the NB－LRR immune receptor Rx in the Solanaceae，thereby dictating Rx function［J］.The Plant Cell，2010，22:4176－4194.

［18］WANG F X，MA Y P，YANG C L，et al.Proteomic analysis of the sea－island cotton roots infected by wilt pathogen Verticillium dahliae［J］.Proteomics，2011，11:1－14.

［19］ZHANG W W，JIAN G L，JIANG T F，et al.Cotton gene expression profiles in resistant Gossypium hirsutum cv.Zhongzhimian KV1 responding to Verticillium dahliae strain V991 infection［J］.Mol Biol Rep，2012，39:9765－9774.

［20］ZHANG W W，WANG S Z，LIU K，et al.Comparative expression analysis in susceptible and resistant Gossypium hirsutum responding to Verticillium dahliae infection by cDNA－AFLP［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，2012，80:50－57.

［21］ZHAO F A，F(xiàn)ANG W P，XIE D Y，et al.Proteomic identification of differentially expressed proteins in Gossypium thurberi inoculated with cotton Verticillium dahliae［J］.Plant Science，2012，4:176－184.

［22］LIU J L，LIU X L，DAI L Y，et al.Recent progress in elucidating the structure，function and evolution of disease resistance genes in plants［J］.Journal of Genet and Genom，2007，34(9):765－776.

［23］VAN DER HOORN R A L，KAMOUN S.From guard to decoy:a new model for perception of plant pathogen effectors［J］.The Plant cell，2008，20:2009－2017

［24］T?R M，LOTZ M T，HOLTON N.Receptor－mediated signalling in plants:molecular patterns and programmes［J］.Journal of Experiment Botany，2009，60(13):3645－3654.

［25］JOSHI R K，NAYAK S.Functional characterization and signal transduction ability of nucleotide－bingding site－leucine－rich repeat resistance genes in plants［J］.Genet and Mol Res，2011，10(4):2637－2652.

［26］SHIRASU K，SCHULZE－LEFERT P.Complex formation，promiscuity and multi－functionality:protein interactions in disease－resistance pathways［J］.Trends Plant Sci，2003，8:252－258.

［27］MEYERS B C，KOZIK A，GRIEGO A，et al.Genome－wide analysis of NBS－LRR－encoding genes in Arabidopsis［J］.The Plant Cell，2003，15:809－834.

［28］MONOSI B，WISSER R J，PENNILL L，et al.Full－genome analysis of resistance gene homologues in rice［J］.Theor Appl Genet，2004，109:1434－1447.

［29］PAN Q，WENDEL J，F(xiàn)LUHR R.Divergent evolution of plant NBS－LRR resistance gene homologues in dicot and cereal genomes［J］.Journal of Mol Evol，2000，50:203－213.

［30］DANGL J L，JONES J D G.Plant pathogens and integrated defense responses to infection［J］.Nature，2001，411:826－833.

［31］MEYERS B C，MORGANTE M，MICHELMORE W.TIR－X and TIR－NBS proteins:Two new families related to disease resistance TIR－NBS－LRR proteins encoded in Arabidopsis and other plant genomes［J］.Plant J，2002，32(1):77－92.

［32］TAN X P，MEYERS B C，KOZIK A，et al.Global expression analysis of nucleotide binding site－leucine rich repeat－encoding and related genes in Arabidopsis［J］.BMC Plant Biol，2007，7:56.

［33］GUTIERREZ J R，BALMUTH A L，NTOUKAKIS V，et al.Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto－like kinases that diversify effector recognition［J］.The Plant Journal，2009，61:507－518.

［34］LOUTRE C，WICKER T，TRAVELLA S，et al.Two different CCNBS－LRR genes are required for Lr10－mediated leaf rust resistance in tetraploid and hexaploid wheat［J］.The Plant Journal，2009，60:1043－1054.

［35］NARUSAKA M S K，SHIRASU K，NOUTOSHI Y，et al.RRS1 and RPS4 provide a dual Resistance－gene system against fungal and bacterial pathogens［J］.The Plant Journal，2009，60(2):218－226.