鹽酸米托蒽醌多囊脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化及性能

劉源崗，鄭琪瑤，王士斌

（1 華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021；2 華僑大學(xué)制藥工程研究所，福建 廈門 361021）

多囊脂質(zhì)體（multivesicular liposomes，MVLs）是采用儲庫泡沫技術(shù)制備的一種結(jié)構(gòu)特殊的新型脂質(zhì)體，其內(nèi)部不連續(xù)的水性內(nèi)腔被非同心的類脂以及磷脂膜所分隔，形成許多細(xì)微的囊泡[1-2]。傳統(tǒng)的單層和多層脂質(zhì)體為同心囊結(jié)構(gòu)，膜一旦破裂，藥物即漏出；MVLs 具有不連續(xù)的囊泡，當(dāng)某個囊泡破裂時，藥物只從破裂的囊泡中釋出，仍可保持完整的囊泡狀態(tài)，因而具有良好的緩釋效應(yīng)（圖1）[3]。由于粒徑較大（1～100 μm），可通過鞘內(nèi)、皮下、腹腔、肌肉、眼內(nèi)、動脈栓塞、瘤體內(nèi)給藥等多種途徑注射給藥，給藥后大部分停留在靶部位，為藥物的緩釋提供儲庫作用[4-5]。由于內(nèi)水相體積較大，尤其適用于包封水溶性小分子和生物活性大分子藥物[6-8]。

圖1 脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)示意圖

鹽酸米托蒽醌（mitoxantrone hydrochloride ，DHAD）是蒽二酮類的合成抗腫瘤藥物，分子量為517.41 Da，親水性強且?guī)д姾?。其抗癌活性與阿霉素相似或略高，明顯高于環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、甲氨喋呤、氟尿嘧啶和長春新堿等常用的抗癌藥物。然而，DHAD 進入血液后大部分（95% 以上）迅速與血漿蛋白結(jié)合，造成了嚴(yán)重的毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)及心臟毒性[9]。為了拓寬其臨床應(yīng)用，研究者制備了各種載體（如脂質(zhì)體、納米載體）[10-11]，但是由于DHAD 為小分子藥物，載體包封率通常較低（＜ 40%）[12]或釋放時間較短（＜ 50 h）[13]。利用DHAD 的正電荷特性，制備陰離子型載體可大幅提高包封率，延長釋放時間[14]。但是，對于中性載體，如何獲取高包封率同時具有較長的釋放時間是一個問題。

因此，可以利用MVLs 的特殊結(jié)構(gòu)特征，制備DHAD-MVLs 復(fù)合物，用以獲得可用于原位注射給藥的DHAD 載體。實驗采用均勻設(shè)計優(yōu)化了制備工藝，考察了DHAD-MVLs 的形貌、粒徑及其分布、Zeta 電位、相變溫度、滲漏率、包封率、體外釋放等指標(biāo)，以期提供一種新的DHAD 藥物載體形式。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

大豆卵磷脂（≥96%，德國Lipoid 公司）；鹽酸米托蒽醌（DHAD，≥99%，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；蔗糖（分析純，汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品公司）；三油酸甘油酯和Triton X-100 為化學(xué)純，其它試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

BS210S 電子分析天平（德國Sartorius）；T25高速勻漿機（德國IKA）；QL-901 旋渦混懸儀（海門其林貝爾）；NE-1001 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA）；BH-2 生物顯微鏡（日本Olympus）；UV-1600PC 紫外分光光度計（上海美譜達(dá)）；TGL-18M 臺式高速冷凍離心機（湖南凱達(dá)）；FDU-2100 冷凍干燥機（日本東京理化器械）；Mastersizer 2000 激光粒度儀（英國馬爾文）；ZetaPALS Zeta 電位儀（英國馬爾文）；DSC2910 差示掃描量熱儀（美國TA）；ZHWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠）。

1.2 空白多囊脂質(zhì)體（MVLs）的制備及工藝優(yōu)化

配制內(nèi)水相（含蔗糖）、外水相（含葡萄糖和L-賴氨酸）及油相（含大豆卵磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯和油酸，二氯甲烷為溶劑）。取一定體積油相溶液和內(nèi)水相溶液混勻，于高速勻漿機上攪拌10 min，轉(zhuǎn)速為20000 r/min，制備初乳。然后向初乳中加入外水相溶液，于旋渦混懸儀上乳化10 s，制備復(fù)乳。隨后將復(fù)乳轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，于35 ℃，10 r/min 的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機溶劑，即得多囊脂質(zhì)體懸液。

選取包封率為指標(biāo)，選擇大豆磷脂的濃度、膽固醇濃度、三油酸甘油酯濃度、L-賴氨酸的濃度、油相/內(nèi)水相體積比和初乳/外水相體積比6 個處方因素進行均勻設(shè)計實驗（表1）。按照均勻設(shè)計實驗和DPS 數(shù)據(jù)分析得出的最優(yōu)條件制備多囊脂質(zhì)體，檢驗所建模型是否正確。

1.3 載DHAD 多囊脂質(zhì)體的制備

DHAD 多囊脂質(zhì)體（DHAD-MVLs）制備方法同上，采用優(yōu)化后的制備工藝，其中內(nèi)水相含0.5 mg/mL DHAD。

1.4 多囊脂質(zhì)體形貌、粒徑及Zeta 電位表征

取適量MVLs及DHAD-MVLs懸液至光鏡下觀察并拍照。另取適量脂質(zhì)體懸液，分散于去離子水中，用激光粒度儀測定其粒度分布及平均粒徑。取離心后的脂質(zhì)體，用外水相重新分散，于Zeta 電位儀上測定脂質(zhì)體的表面電位。

1.5 相變溫度測定

取適量大豆磷脂、MVLs 和DHAD-MVLs 的凍干粉末，于差示掃描量熱儀上測其相轉(zhuǎn)變溫度。大豆磷脂的測試條件為-30～50 ℃，空白脂質(zhì)體和載藥脂質(zhì)體的測試條件為10～70 ℃，升溫速度均為5 ℃/min。

1.6 藥物滲漏率測定

1.6.1 DHAD 穩(wěn)定性考察

配制0.01 mg/mL的DHAD溶液，分別放于4 ℃和37 ℃搖床中，在兩種環(huán)境下放置生理鹽水溶液作為參比液，于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 取出一定的溶液測定吸光度，做DHAD 的濃度對應(yīng)不同時間點曲線圖，反映其穩(wěn)定性。

1.6.2 藥物滲漏率考察

樣品置于4 ℃和37 ℃，于一定時間（12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 和144 h）測定脂質(zhì)體包封率的變化，計算藥物的滲漏率，繪制滲漏率隨時間變化的曲線。藥物的滲漏率按下式計算

1.7 體外緩釋性能考察

將制備的脂質(zhì)體，離心取沉淀，用適量生理鹽水將脂質(zhì)體重懸。在低速磁力攪拌下，分別取5 mL脂質(zhì)體懸液到已編號（1～15）的15 mL 的離心管內(nèi)，另加5 mL 生理鹽水作為釋放介質(zhì)。將離心管放于37℃，30 r/min 的搖床中，分別于設(shè)定的時間點（0.5 h，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h，84 h，96 h，108 h 和120 h）取出同一編號的15 mL 離心管，2500 r/min 離心10 min后用生理鹽水重懸，再次離心洗滌。棄去上清液，加入50 g/L 的Triton X-100 乙醇溶液破囊，測其在663 nm 處的吸光值，計算釋放百分率并繪制釋放曲線。藥物的累積釋放率（%）按下式計算

式中，Q0為釋放開始前脂質(zhì)體包封的藥量；Qt為t 時刻脂質(zhì)體中剩余的藥量。

分別制備不同膽固醇用量（4 mg/mL，12 mg/mL，20 mg/mL）及三油酸甘油酯用量（4 mg/mL，12 mg/mL，20 mg/mL）的多囊脂質(zhì)體，考察膽固醇用量及三油酸甘油酯對脂質(zhì)體釋放性能的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 多囊脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化

均勻設(shè)計實驗結(jié)果如表1 所示。利用DPS 軟件對實驗結(jié)果進行二次多項式逐步回歸，得到回歸方程：Y=43.35+139.03X6-0.36X52-101.90X62+0.26X2X5- 3.67X3X6+0.04X1X4（R=0.935，F(xiàn)=8.40，P= 0.011）。方程通過F 值檢驗，具有顯著性，可以通過目標(biāo)函數(shù)進行優(yōu)化和預(yù)測。用DPS 軟件進行二次多項式回歸分析，尋找目標(biāo)函數(shù)為最大值時的各變量的值。DPS 軟件的輸出結(jié)果如表2 所示。

根據(jù)上述分析結(jié)果并結(jié)合實際情況，選擇以下條件進行驗證實驗：大豆磷脂濃度16 mg/mL，膽固醇濃度12 mg/mL，三油酸甘油酯濃度12 mg/mL，L-Lys 濃度40 mmol/L，油相/內(nèi)水相體積比1∶1，初乳/外水相體積比2∶3，內(nèi)水相蔗糖濃度50 g/L，外水相葡萄糖濃度75 g/L，以二氯甲烷為有機溶劑制備三批多囊脂質(zhì)體，并測定鹽酸米托蒽醌的包封率，結(jié)果分別為88.63%、91.26%和90.51%，平均包封率為90.13%，接近預(yù)測值89.10%，且高于均勻設(shè)計各實驗組包封率。因此，經(jīng)過均勻設(shè)計優(yōu)化制備工藝，脂質(zhì)體的包封率得到了較大的提高。

表1 均勻設(shè)計實驗表

表2 DPS 回歸分析結(jié)果

2.2 多囊脂質(zhì)體形貌、粒徑及Zeta 電位

由圖2(a)可知，制備的脂質(zhì)體呈卵形或圓形，內(nèi)部的多囊泡結(jié)構(gòu)中包封有大量的鹽酸米托蒽醌溶液。空白脂質(zhì)體（MVLs）和鹽酸米托蒽醌多囊脂質(zhì)體（DHAD-MVLs）的平均粒徑分別為59.78 μm和58.75 μm，粒徑跨距分為1.44 和1.10。鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體的粒度分布較窄，粒度趨于均勻[圖2(b)]。MVLs 和DHAD-MVLs 的Zeta 電位分別 為-45.6 mV 和-47.1 mV，均為穩(wěn)定體系，可見鹽酸米托蒽醌的加入沒有降低脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

2.3 相變溫度

相變溫度是磷脂膜從膠晶相向液晶相轉(zhuǎn)變時的臨界溫度。當(dāng)周圍溫度在脂質(zhì)體相變溫度以下時，脂質(zhì)雙分子層排列緊密，流動性小，藥物滲漏較小，而隨著溫度升高，脂質(zhì)膜發(fā)生相變，膜的橫切面增大，通透性和流動性增大，藥物會加速從脂質(zhì)體中滲漏，因此，相變溫度是衡量脂質(zhì)體穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。由圖3(a)、(b)可見，空白多囊脂質(zhì)體相 轉(zhuǎn)變溫度為39.2 ℃，載藥多囊脂質(zhì)體的相轉(zhuǎn)變溫度為38.8 ℃，并無明顯差異。由圖3(c)，天然大豆磷脂的相轉(zhuǎn)變溫度為-23 ℃，與圖3 (a)、(b)比較可知，膽固醇的加入在很大程度上提高了脂質(zhì)體的相變溫度，起到了穩(wěn)定脂質(zhì)膜的作用。

圖2 DHAD-MVLs 的形貌和粒徑分布

2.4 藥物滲漏率

如圖4 所示，鹽酸米托蒽醌在4 ℃和37 ℃環(huán)境下，72 h 內(nèi)的吸光值基本穩(wěn)定，具有良好的穩(wěn)定性，說明在本實驗環(huán)境下進行藥物的包封和釋放的考察是可行的，可以利用分光光度法測定鹽酸米托蒽醌的含量。

此外，脂質(zhì)體懸液于37 ℃和4 ℃保存時，168 h的滲漏率分別為55.9%和23.68%，脂質(zhì)體懸液在兩種條件下保存時藥物均有一定程度的滲漏。由圖5 可知，脂質(zhì)體在4 ℃環(huán)境保存時，脂質(zhì)體的滲漏率較低，且隨時間增大的趨勢較緩。

圖3 MVLs、DHAD-MVLs 和大豆磷脂的差熱分析

圖4 DHAD 在不同溫度下的穩(wěn)定性

圖5 不同溫度對脂質(zhì)體懸液滲漏率的影響

2.5 體外釋放

由圖6 可知，鹽酸米托蒽醌能夠從多囊脂質(zhì)體中緩慢釋放。膽固醇的用量分別為4 mg/mL、12 mg/mL 和20 mg/mL 時，多囊脂質(zhì)體在前0.5 h 內(nèi)的藥物釋放量分別為23.43%、13.02%和10.27%，均低于40%，沒有明顯的突釋現(xiàn)象。膽固醇用量過高（20 mg/mL）或過低（4 mg/mL）都會導(dǎo)致藥物加速從脂質(zhì)體中釋放。當(dāng)膽固醇用量為4 mg/mL 時，鹽酸米托蒽醌在60 h 左右就釋放了90%以上。在120 h 時，12 mg/mL 和20 mg/mL 組的藥物釋放量分別為80.68%和83.04%，符合《藥典》的規(guī)定。分析認(rèn)為，膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動性的作用，加入適量的膽固醇可以提高脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性，使藥物的釋放速率減緩，而過量的膽固醇反而可能會增加膜的剛性而導(dǎo)致脂質(zhì)膜更加容易破裂[15-16]，從而導(dǎo)致藥物加速釋放。

圖6 膽固醇用量對脂質(zhì)體釋放性能的影響

圖7 三油酸甘油酯用量對脂質(zhì)體釋放性能的影響

由圖7 可知，不同三油酸甘油酯用量的脂質(zhì)體也能實現(xiàn)藥物的緩慢釋放，前0.5 h 時，4 mg/mL、 12 mg/mL 和20 mg/mL 組的脂質(zhì)體的釋藥量分別為11.55%、13.25%和12.04%，均無突釋現(xiàn)象。120 h時，三組的藥物累積釋放量分別為74.16%、82.98%和87.04%。因此，降低三油酸甘油酯的用量有利于提高多囊脂質(zhì)體的緩釋效果。分析認(rèn)為，三油酸甘油酯主要起架橋、連接和穩(wěn)定多囊脂質(zhì)體內(nèi)部囊泡的作用。張淼等[17]報道，甘油三酯的碳鏈長度對脂質(zhì)體的釋放速率有很大的影響。實驗中所用的三油酸甘油酯為烷基鏈長為18C 的長鏈甘油三酯，具有較好的緩釋效果，但是過多的三油酸甘油酯會以小液滴的形式存在于內(nèi)水相中，可能會改變內(nèi)水相的酸堿度且會破壞脂質(zhì)體內(nèi)外水相的滲透壓，從而降低緩釋效果。

3 結(jié) 論

通過實驗優(yōu)化了載鹽酸米托蒽醌多囊脂質(zhì)體的制備工藝，所制得的MVLs 粒徑分布均勻、球形度及穩(wěn)定性良好；考察了體系的相變溫度、滲漏率及不同因素對多囊脂質(zhì)體緩釋性能的影響。具體實驗結(jié)論如下。

（1）優(yōu)化后制備工藝如下：大豆磷脂濃度16mg/mL，膽固醇濃度12 mg/mL，三油酸甘油酯濃度12 mg/mL，L-Lys 濃度40 mmol/L，油相/內(nèi)水相體積比1∶1，初乳/外水相體積比2∶3。DHAD-MVLs平均包封率為90.13%，包封率高。

（2）鹽酸米托蒽醌多囊脂質(zhì)體呈圓形或卵形，平均粒徑為58.75 μm，粒徑跨距為1.10，Zeta 電 位為-47.1 mV，相轉(zhuǎn)變溫度為38.8 ℃。制備的鹽酸米托蒽醌多囊脂質(zhì)體屬于穩(wěn)定體系，與空白脂質(zhì)體比較，DHAD 的加入對脂質(zhì)體的性能基本沒有 影響。

（3）脂質(zhì)體懸液放于37 ℃與4 ℃，168 h 的滲漏率分別為55.9%和23.68%，脂質(zhì)體懸液于4 ℃保存時較穩(wěn)定。

（4）膽固醇用量過高（20 mg/mL）或過低（4 mg/mL）都會導(dǎo)致鹽酸米托蒽醌加速從脂質(zhì)體中釋放，而降低三油酸甘油酯的用量則有利于進一步提高多囊脂質(zhì)體的緩釋效果。

（5）釋放過程中，脂質(zhì)體0.5 h 內(nèi)的藥物釋放量均遠(yuǎn)低于40%，沒有突釋現(xiàn)象；120 h 后，藥物釋放較完全，藥物累計釋放量大于80%，兩組特征值均符合《藥典》規(guī)定。

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