異養(yǎng)產(chǎn)油單針藻的生長(zhǎng)、代謝及脂肪酸組成的變化

王 琳，鄧 濤，徐軍偉，趙 鵬，李 濤，余旭亞

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)是在自養(yǎng)培養(yǎng)基中加入有機(jī)碳源，在黑暗條件下進(jìn)行需氧發(fā)酵生長(zhǎng)，消除了光對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。通常異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的生長(zhǎng)速度快，較易獲得更大的生物量，縮短了培養(yǎng)周期。但并不是所有的微藻都可以進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，需要通過(guò)異養(yǎng)化篩選，找到能異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻。篩選新的產(chǎn)油微藻，探索其適宜的培養(yǎng)方式，是產(chǎn)油微藻近幾年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

微藻的生長(zhǎng)繁殖不僅與藻種自身有關(guān)，與培養(yǎng)條件也有較大的關(guān)系。培養(yǎng)基中含有大量的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素。氮、磷是合成藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸 的重要元素，對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂有重要作用[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在氮、磷限制的情況下，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)緩慢。而在氮、磷豐富的情況下，藻細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。但是高濃度的氮、磷對(duì)一些藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。

單針藻Monoraphidium sp. FXY-10 是分離自云南高原淡水湖、既能自養(yǎng)也能異養(yǎng)的產(chǎn)油微藻。前期研究結(jié)果表明[3]，自養(yǎng)培養(yǎng)藻細(xì)胞含油量達(dá)到56.8%，異養(yǎng)條件下的含油脂為37.56%，其細(xì)胞油脂產(chǎn)率可達(dá)148.74 mg/(L·d)，比自養(yǎng)培養(yǎng)的細(xì)胞油脂產(chǎn)率6.88 mg/(L·d)高21.6 倍；脂肪酸組成特性表明，異養(yǎng)單針藻油脂是制備生物柴油較好的原料。

本文通過(guò)分析異養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗的動(dòng)態(tài)變化，建立相關(guān)的動(dòng)力學(xué)模型，并對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程中脂肪酸組成變化進(jìn)行分析，以期為后期放大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)基

藻種：?jiǎn)吾樤澹∕onoraphidium sp. FXY-10），前期實(shí)驗(yàn)篩選保藏。

培養(yǎng)基：BG-11 培養(yǎng)基添加葡萄糖（10.0 g/L）。

1.2 儀器設(shè)備

恒溫?fù)u床、Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)、Specord Plus 分光光度儀、EYELA FDU-2000 真空冷凍干燥機(jī)、安捷倫7890GC-5975MSD 氣質(zhì)聯(lián)用儀等。

1.3 培養(yǎng)條件

采用500 mL 的三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，裝液量為250 mL，接種的藻細(xì)胞密度控制在106/mL，溫度25±0.2 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。每隔24 h 取樣檢測(cè)藻細(xì)胞密度、營(yíng)養(yǎng)鹽、脂肪酸成分的變化。藻細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，采收藻細(xì)胞。

1.4 分析方法

1.4.1 檢測(cè)方法

采用標(biāo)準(zhǔn)的水樣分析方法檢測(cè)硝酸鹽的含量和磷酸鹽的含量[4]，氣相色譜分析[3]脂肪酸組成。

1.4.2 藻細(xì)胞生物量測(cè)定

以680 nm 吸光度值表征藻細(xì)胞生物量，如 式（1）。

式中，X 為藻細(xì)胞生物量，g/L；z 為藻細(xì)胞在680 nm 下的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 采用Richards 模型研究藻細(xì)胞的生長(zhǎng)

Richards 生長(zhǎng)函數(shù)是一類用數(shù)學(xué)演繹法導(dǎo)出的理論生長(zhǎng)方程，能夠準(zhǔn)確模擬生物生長(zhǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)方程[5-6]。曾文爐等[7]采用Richards 方程擬合光生物反應(yīng)器中螺旋藻的批式和連續(xù)培養(yǎng)下的生長(zhǎng)模型，如式（2）。

式中，X 是藻細(xì)胞生物量，g/L；A 是生物生長(zhǎng)上限；B 是細(xì)胞生長(zhǎng)初始參數(shù)；k 是同化生長(zhǎng)速率常數(shù)；m 是異速生長(zhǎng)參數(shù)；t 是培養(yǎng)時(shí)間。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出單針藻的生長(zhǎng)曲線，如 式（3）。

對(duì)式（3）進(jìn)行一階、二階、三階求導(dǎo)，得式（4）～式（6）。

對(duì)式（5）、式（6）進(jìn)行分析可知。

（1）令二階導(dǎo)數(shù)為零，可求得藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率最大時(shí)的坐標(biāo)及最大比生長(zhǎng)速率。

其坐標(biāo)為 t=6.598，X=3.807

（2）令三階導(dǎo)數(shù)為零，可求得藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率曲線的兩個(gè)拐點(diǎn)。

式中，t1是藻細(xì)胞由延遲期到對(duì)數(shù)期的時(shí)間分界點(diǎn)；t2是對(duì)數(shù)期到穩(wěn)定期的時(shí)間分界點(diǎn)。它們分別對(duì)應(yīng)于藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率加速度的極值點(diǎn)。

采用Richards 模型能夠較好地?cái)M合出藻細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)，并且根據(jù)模型能夠得出藻細(xì)胞的最大生物量及最大比生長(zhǎng)速率，有益于對(duì)后期采收時(shí)間的控制。

2.2 藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中底物的消耗

目前，有大量文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝的動(dòng)力學(xué)研究[8-9]，Shi 等[10]在研究不同氮源對(duì)C.protothecoides CS-41 的細(xì)胞生長(zhǎng)和葉黃素合成影響，在此基礎(chǔ)上建立了動(dòng)力學(xué)模型，基于該模型，構(gòu)建單針藻兼養(yǎng)分批培養(yǎng)底物消耗模型。模型如 式（7）。

式中，P 是產(chǎn)物濃度，μg/mL；S 是底物的濃度，g/L；YXS為生物量對(duì)底物的得率系數(shù)，g/g；YPS為生物量對(duì)產(chǎn)物的得率系數(shù)，g/g；ms模型參數(shù)。

此模型考慮了產(chǎn)物合成對(duì)底物消耗的作用，研究發(fā)現(xiàn)，在建模過(guò)程中，葉綠素a 的合成對(duì)底物消耗的影響較小，因此忽略不計(jì)，此模型修正為式（8）。

對(duì)此模型積分，得式（9）。

式中，e 為模型參數(shù)。

2.2.1 硝酸鹽的消耗

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合的硝酸鹽消耗的動(dòng)力學(xué)模型如式（10）。

積分，得式（11）。

生物量對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)為Y=5.319。

該模型能夠較好地模擬培養(yǎng)基中硝酸鹽的變化趨勢(shì)，另外也說(shuō)明了藻細(xì)胞對(duì)硝酸鹽的消耗情況。圖1 為硝酸根與磷酸根濃度的變化曲線。由圖1 看出，硝酸鹽的消耗速率變化不明顯，并且在藻細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)末期硝酸鹽的含量很小，且變化不明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境中硝酸鹽濃度很低時(shí)，藻細(xì)胞能夠迅速利用胞內(nèi)儲(chǔ)存的硝酸鹽進(jìn)行增殖[11-12]。模型中得出生物量對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)為5.319 g/g。已有研究報(bào)道Chlamydomonas reinhardtii 的生物量對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)為0.4803 g/g[13]。Chlorella 的生物量對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)為3.4981 g/g[14]。與以上報(bào)道的得率系數(shù)相比單針藻生物量對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)較大，也說(shuō)明硝酸鹽對(duì)單針藻的生長(zhǎng)影響較為顯著。

2.2.2 磷酸鹽的消耗

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合的磷酸鹽消耗的動(dòng)力學(xué)模型，得式（12）。

積分，得式（13）。

生物量對(duì)磷酸鹽的得率系數(shù)Y=500。

該模型能夠模擬培養(yǎng)基中磷酸鹽的變化趨勢(shì)，另外也顯示出了藻細(xì)胞對(duì)磷酸鹽的消耗情況。由圖1 可發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)期磷酸鹽的消耗速率較大，在藻細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)末期檢測(cè)的磷酸鹽含量變化不明顯。有研究得出，當(dāng)環(huán)境中的磷酸鹽濃度很低時(shí)，藻細(xì)胞能夠迅速利用胞內(nèi)儲(chǔ)存的磷酸鹽進(jìn)行增 殖[11，15]。模型中計(jì)算得出生物量對(duì)磷酸鹽的得率系數(shù)高達(dá)500 g/g。生物量對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)為5.319 g/g。生物量對(duì)磷酸鹽的得率系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)，說(shuō)明磷酸鹽對(duì)單針藻的生長(zhǎng)影響大于硝酸鹽，即磷酸鹽濃度的增加更易促進(jìn)單針藻的生長(zhǎng)。

2.3 脂肪酸組成變化

不同藻種的脂肪酸組成存在很大差異[16]。表1表明，單針藻在異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的脂肪酸主要為C16∶0 、C16∶3、 C16∶4、 C18∶1 和C18∶3。在培養(yǎng)初期僅有C16∶0 存在，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，C16∶0 含量隨之增加，在穩(wěn)定期C16∶0 含量相對(duì)減小。第5、第6 天藻細(xì)胞開(kāi)始合成C16∶4，而在對(duì)數(shù)末期和穩(wěn)定期均未出現(xiàn)。生長(zhǎng)至第7 天C16∶3 合成開(kāi)始，隨時(shí)間的增加C16∶3 的含量逐漸減少。第4 天脂肪酸C18∶3 合成開(kāi)始出現(xiàn)，至對(duì)數(shù)期C18∶3 含量增加，而穩(wěn)定期未測(cè)出C18∶3。穩(wěn)定期有C18∶1 合成，隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，C18∶1 含量呈增加趨勢(shì)。據(jù)此推測(cè)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，C18∶3 會(huì)大量轉(zhuǎn)化為C18∶1，延長(zhǎng)藻細(xì)胞的培養(yǎng)穩(wěn)定期可增加C18∶1 的含量。

在藻細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中，飽和脂肪酸的含量隨著時(shí)間的增加而增加，到達(dá)穩(wěn)定期后飽和脂肪酸的含量變化不大；在對(duì)數(shù)期，多不飽和脂肪酸的含量隨著時(shí)間的增加而增加，進(jìn)入穩(wěn)定期后，多不飽和脂肪酸的含量急劇減少；在穩(wěn)定期，單不飽和脂肪酸的含量高達(dá)57.24%。脂肪酸的組成和結(jié)構(gòu)，如不飽和度、碳鏈長(zhǎng)度等決定了生物柴油的特性，如辛烷值、黏度、低溫流動(dòng)性、碘值、氧化穩(wěn)定性等[17]。飽和脂肪酸含量高，所制備的生物柴油辛烷值高，氧化穩(wěn)定性好，但低溫流動(dòng)性差，低溫下易膠體化；如果單不飽和脂肪酸含量高，雖產(chǎn)品的低溫流動(dòng)性好，但可能導(dǎo)致氧化穩(wěn)定性下降[18]。因此，生物柴油的理想原料是油脂中含有較高含量的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸。本實(shí)驗(yàn)中飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的含量分別高達(dá)30.75%和57.24%。基于較高的含油量、飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的含量。單針藻是適用于生物柴油生產(chǎn)的一種較好的原材料。

表1 藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中脂肪酸組成的變化

3 結(jié) 論

通過(guò)考察單針藻批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)及其對(duì)硝酸鹽、磷酸鹽的利用特性，分析了單針藻生長(zhǎng)過(guò)程中脂肪酸的變化情況。得出以下結(jié)論。

（1）可以用Richards 模型擬合藻細(xì)胞的生長(zhǎng)與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系。t=6.598 是細(xì)胞生長(zhǎng)的拐點(diǎn)，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率最大；t=6.500 和t=6.696 則分別表示細(xì)胞由停滯期進(jìn)入指數(shù)期和由指數(shù)期到穩(wěn)定期的分界點(diǎn)，既是藻細(xì)胞生長(zhǎng)加速度的兩個(gè)極值點(diǎn)，又是藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速度曲線的兩個(gè)拐點(diǎn)。

（2）建立了微藻細(xì)胞對(duì)硝酸鹽、磷酸鹽的代謝模型，得出藻細(xì)胞生物量對(duì)硝酸鹽、磷酸鹽的得率系數(shù)分別為5.319 g/g、500 g/g。生物量對(duì)磷酸鹽的得率系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)硝酸鹽的得率系數(shù)，說(shuō)明磷酸鹽對(duì)單針藻的生長(zhǎng)影響大于硝酸鹽。

（3）分析了單針藻生長(zhǎng)過(guò)程中脂肪酸組成變 化情況，發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定期飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的含量較高；同時(shí)，延長(zhǎng)藻細(xì)胞的培養(yǎng)穩(wěn)定期可增加C18∶1 的含量。

[1] Harwood J L，Jones A L. Lipid metabolism in Algae[J].Advances in Botanical Research，1989，16：1-53.

[2] Goldstein A，Baertlein D，Danon A. Phosphate starvation stress as an experimental system for molecular analysis[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1989，7（1）：7-16.

[3] Yu X，Zhao P，He C，et al. Isolation of a novel strain of Monoraphidium sp. and characterization of its potential application as biodiesel feedstock[J]. Bioresource Technology，2012，121：256-262.

[4] Octavio P G，luz E D B，Hernandez J P，et al. Efficiency of growth and nutrient uptake from wastewater by heterotrophic，autotrophic，and mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris immobilized with Azospirillum brasilense[J]. Journal of Phycology，2010，46（4）：800-812.

[5] Richards F，Thompson T. The estimation and characterization of plankton populations by pigment analyses. Ⅱ . A spectrophotometric method for the estimation of plankton pigments[J]. Journal of Marine Research，1952，11（2）：156-172.

[6] Richards F J. A flexible growth function for empirical use[J]. Journal of Experimental Botany，1959，10（2）：290-301.

[7] 曾文爐，蔡昭鈴，歐陽(yáng)藩. 螺旋藻批式與連續(xù)培養(yǎng)及其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2001，17（4）：414-419.

[8] Surisetty K，Hoz Siegler H D l，McCaffrey W C，et al. Model re-parameterization and output prediction for a bioreactor system[J]. Chemical Engineering Science，2010，65（16）：4535-4547.

[9] Zhang X W，Chen F，Johns M R. Kinetic models for heterotrophic growth of Chlamydomonas reinhardtii in batch and fed-batchcultures[J]. Process Biochemistry，1999，35（3-4）：385-389.

[10] Shi X M，Zhang X W，Chen F. Heterotrophic production of biomass and lutein by Chlorella protothecoides on various nitrogen sources[J]. Enzyme and Microbial Technology，2000，27（3-5）：312-318.

[11] Cembella A D，Antia N J，Harrison P J. The utilization of inorganic and organic phosphorous compounds as nutrients by eukaryotic microalgae Part I：A multidisciplinary perspective[J]. Critical Reviews in Microbiology，1982，10（4）：317-391.

[12] Li Y，Horsman M，Wang B，et al. Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid accumulation of green alga Neochloris oleoabundans[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，81（4）：629-636.

[13] Zhang X W，Chen F，Johns M R. Kinetic models for heterotrophic growth of Chlamydomonas reinhardtii in batch and fed-batch cultures[J]. Process Biochemistry，1999，35（3-4）：385-389.

[14] Wu Z Y，Shi C L，Shi X M. Modeling of lutein production by heterotrophic Chlorella in batch and fed-batch cultures[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，23（9）：1233-1238.

[15] Hoppe H G. Phosphatase activity in the sea[J]. Hydrobiologia，2003，493（1-3）：187-200.

[16] Renaud S M，Thinh L V，Parry D L. The gross chemical composition and fatty acid composition of 18 species of tropical Australian microalgae for possible use in mariculture[J]. Aquaculture，1999，170（2）：147-159.

[17] Liu J，Huang J，Sun Z，et al. Differential lipid and fatty acid profiles of photoautotrophic and heterotrophic Chlorella zofingiensis：Assessment of algal oils for biodiesel production[J]. Bioresource Technology，2011，102（1）：106-110.

[18] Hu Q，Sommerfeld M，Jarvis E，et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production：Perspectives and advances[J]. The Plant Journal，2008，54（4）：621-639.