• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    艾塞那肽對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中VCAM-1、ICAM-1表達的影響

    2013-08-02 03:56:50陳若然梁琳瑯王健美王宇
    解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2013年6期
    關(guān)鍵詞:艾塞那鈣片高脂

    陳若然,梁琳瑯,王健美,王宇

    艾塞那肽對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中VCAM-1、ICAM-1表達的影響

    陳若然,梁琳瑯,王健美,王宇

    目的探討胰高血糖素樣肽1(GLP-1)受體激動劑艾塞那肽對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中主動脈病變的影響。方法 ApoE-/-小鼠隨機分為普通飲食組(n=14)和高脂飲食組(n=68),喂養(yǎng)12周后隨機抽取普通飲食組4只和高脂飲食組8只小鼠檢測造模情況。將高脂飲食組小鼠再分為非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組(每組10只)。藥物干預(yù)6周后,各組小鼠眶周靜脈叢取血,并取主動脈弓行石蠟切片,HE染色觀察。ELISA法檢測血清血脂水平,Western blotting檢測主動脈血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的蛋白表達水平。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示:普通飲食組及阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組鏡下觀察未見異常;阿托伐他汀鈣片組,艾塞那肽小、大劑量組,阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組可見廣泛的病理性內(nèi)膜增厚;非藥物干預(yù)組有脂質(zhì)斑塊形成,可見脂核。單獨應(yīng)用艾塞那肽或聯(lián)合阿托伐他汀可不同程度降低血清血脂(TC、TG、LDL-C)水平(P<0.05)。艾塞那肽不同劑量單獨或聯(lián)合阿托伐他汀可降低主動脈VCAM-1、ICAM-1的表達(P<0.05)。結(jié)論艾塞那肽可能通過下調(diào)ApoE-/-小鼠主動脈VCAM-1、ICAM-1的表達,抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變的形成。

    艾塞那肽;動脈粥樣硬化;載脂蛋白E類;小鼠,基因敲除;血管細(xì)胞黏附分子-1;胞間黏附分子-1

    [Key words]exenatide; atherosclerosis; apolipoproteins E; mice, knockout; vascular cell adhesion molecule-1; intercellular adhesion molecule-1

    糖尿病患者的高糖、高脂狀態(tài)可直接影響心血管系統(tǒng),引起心血管并發(fā)癥,嚴(yán)重危害患者的生命健康。動脈粥樣硬化(AS)是糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ),而高糖、高脂在AS形成中的作用很難獨立區(qū)分[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),胰高血糖素樣肽1(GLP-1)不僅具有血糖依賴性促胰島素分泌的降血糖作用[3],還可減輕體重、改善血脂[4],對心血管系統(tǒng)也有一定的保護效應(yīng)[5-6]。目前關(guān)于GLP-1對AS的直接效應(yīng)報道較少,本研究探討了GLP-1受體激動劑艾塞那肽對高脂干預(yù)的ApoE-/-小鼠AS病變的作用,旨在為防治和延緩糖尿病大血管病變提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1動物及飼料 SPF級雄性健康A(chǔ)poE-/-小鼠[北京華阜康生物科技股份有限公司,動物許可證號:SGSK(京)2009-0004],5~7周齡,體重17~27g,分籠(5~6只/籠)喂養(yǎng),自由進食、飲水,12h明暗交替,溫度23±2℃,濕度55%~65%。普通、高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司;高脂飼料成分為(每100g計):普通飼料79.85g,脂肪15g,蛋黃粉5g,膽固醇0.15g,經(jīng)60鈷滅菌后真空壓縮包裝。

    1.2藥物 阿托伐他汀鈣片(立普妥,輝瑞制藥有限公司);艾塞那肽注射液(百泌達,美國禮來公司)。

    1.3主要試劑 甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(南京建成生物工程研究所);小鼠血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)抗體、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)抗體(美國R&D Systems公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo公司);高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

    1.4研究方法 ApoE-/-小鼠在基礎(chǔ)飼料條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7d,隨機分為普通飲食組(n=14)和高脂飲食組(n=68)。喂養(yǎng)12周后隨機抽取普通飲食組4只、高脂飲食組8只檢測造模情況。將其余高脂飲食組小鼠分為6組(每組10只),即非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組。阿托伐他汀鈣片劑量為10mg/(kg·d),艾塞那肽小、大劑量分別為1.2、100μg/(kg·d)。進行相關(guān)藥物干預(yù)6周后,小鼠禁食12h,眶周靜脈叢取血,腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(1mg/kg),解剖胸主動脈弓及主動脈,一部分用4%多聚甲醛溶液固定,一部分于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5指標(biāo)檢測

    1.5.1血清血脂水平檢測 TG、TC采用酶法測定,LDL-C采用選擇性沉淀法測定。

    1.5.2主動脈弓石蠟切片HE染色 4%多聚甲醛溶液中已固定好的胸主動脈弓經(jīng)梯度乙醇脫水(70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯透明,石蠟包埋,常規(guī)切片(厚度4μm),HE染色,中性樹膠封固,顯微鏡下攝片。

    1.5.3Western blotting檢測主動脈中VCAM-1、ICAM-1的蛋白表達 每組分別取胸主動脈血管4根,用PBS沖洗干凈后剪碎組織,按1mg組織加入15μl預(yù)冷的裂解液(含終濃度1mmol/L的PMSF)于冰上裂解20min,收集裂解組織,4℃、13 000r/min離心15min,取上清;使用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度;常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后結(jié)合VCAM-1、ICAM-1一抗,以β-actin為內(nèi)參照,4℃孵育過夜;TBST洗膜10min×4次,加入相應(yīng)二抗,再次洗膜;與化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)PVDF膜共孵育1min,入暗室將PVDF膜與X線片于壓片盒中曝光,顯影后再定影。掃描膠片,用Quantity One軟件分析條帶光密度值,以VCAM-1、ICAM-1與β-actin條帶的光密度比值評定VCAM-1、ICAM-1蛋白表達水平。

    1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)用±s表示。兩樣本比較采用t檢驗,多樣本比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1AS模型的建立 喂養(yǎng)12周后,高脂飲食組未見明顯AS斑塊形成,但可見脂質(zhì)條紋,內(nèi)膜中膜厚度較普通飲食組增厚,提示AS造模成功(圖1)。

    圖1 普通飲食組和高脂飲食組主動脈弓病理形態(tài)學(xué)變化(×200)Fig.1 Pathomorphological change of aortic arch of mice in normal diet group (left) and high-fat diet group (right) (×200)

    2.2血清脂質(zhì)代謝水平 非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組TC、LDL-C水平明顯高于普通飲食組(P<0.05);艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組LDL-C水平明顯低于非藥物干預(yù)組(P<0.05);阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組TG水平明顯高于普通飲食組,TC、LDL-C水平明顯低于非藥物干預(yù)組(P<0.05,表1)。

    2.3各組主動脈弓病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示:普通飲食組及阿托伐他汀+艾塞那肽大劑量組內(nèi)膜結(jié)構(gòu)未見異常;非藥物干預(yù)組內(nèi)膜形成脂質(zhì)斑塊,可見脂核;阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小/大劑量組、阿托伐他汀+艾塞那肽小劑量組可見廣泛的病理性內(nèi)膜增厚(圖2)。

    2.4動脈組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達水平比較 與普通飲食組相比,除阿托伐他汀鈣片組外,其余各組的VCAM-1表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與非藥物干預(yù)組相比,除艾塞那肽小劑量組外,其余各組VCAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與阿托伐他汀鈣片組相比,除普通飲食組外,其余各組VCAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各藥物干預(yù)組之間VCAM-1的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與普通飲食組相比,非藥物干預(yù)組、阿托伐他汀鈣片組、艾塞那肽小劑量組、艾塞那肽大劑量聯(lián)合阿托伐他汀組ICAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與非藥物干預(yù)組相比,各組ICAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與阿托伐他汀鈣片組相比,各組ICAM-1的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各藥物干預(yù)組之間ICAM-1的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

    表1 藥物干預(yù)對ASApoE-/-小鼠血清血脂的影響(mmol/L,±s,n=10)Tab.1 Effects of drug intervention on the levels of serum lipid in ApoE-deficient mice with atherosclerosis (mmol/L,±s, n=10)

    表1 藥物干預(yù)對ASApoE-/-小鼠血清血脂的影響(mmol/L,±s,n=10)Tab.1 Effects of drug intervention on the levels of serum lipid in ApoE-deficient mice with atherosclerosis (mmol/L,±s, n=10)

    (1)P<0.05 compared with normal diet group; (2)P<0.05 compared with non-drug intervention group; (3)P<0.05 compared with atorvastatin group

    TC TG LDL-C Normal diet 8.29±2.93 1.77±0.69 2.44±1.04 Non-drug intervention 13.63±1.48(1) 2.16±0.65 6.02±1.66(1)Atorvastatin 13.46±2.37(1) 2.18±0.99 4.99±2.17(1)Exenatide low -dose 10.98±1.22 1.82±0.45 2.02±1.62(2)(3)Exenatide high-dose 9.68±3.60(2) 1.75±0.42 2.34±0.81(2)(3)Atorvastatin + exenatide low -dose 10.04±0.27 1.51±0.23 1.28±1.08(2)(3)Atorvastatin + exenatide high-dose 9.24±1.81(2)(3) 2.88±0.51(1) 0.89±0.74(2)(3)Group

    圖2 各組主動脈弓病理形態(tài)學(xué)變化(HE ×200)Fig.2 Pathomorphological change of aortic arch of mice in each group (HE ×200)

    3 討 論

    AS是一種累及全身大、中動脈內(nèi)膜的慢性炎癥性疾病,炎癥反應(yīng)貫穿其發(fā)生發(fā)展的全過程。在高脂等致炎因子的作用下,多種黏附分子活化并與單核細(xì)胞表面受體結(jié)合,促使單核細(xì)胞黏附到損傷的內(nèi)皮上,這是AS早期病變的重要特征之一[7-8]。黏附分子在介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及其相互作用方面起到了關(guān)鍵作用,影響著AS病變的形成與發(fā)展。VCAM-1是一種介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附及相互作用的膜表面糖蛋白,在內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及平滑肌細(xì)胞表面表達。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族,可表達于白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞,尤其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達最強。ICAM-1在活性內(nèi)皮細(xì)胞上的表達是組織損傷和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[9-10]。VCAM-1和ICAM-1在抗原表達過程中可以作為淋巴細(xì)胞的共刺激信號,在AS中進一步發(fā)揮作用。

    圖3 主動脈內(nèi)VCAM-1、ICAM-1的蛋白表達Fig.3 Protein expression of VCAM-1 and ICAM-1 in aorta

    GLP-1是一種由腸道L細(xì)胞分泌的重要的腸促胰素,可通過以葡萄糖依賴方式促進胰島素分泌,抑制胰高血糖素分泌,延緩胃排空,增加飽腹感等作用維持血糖的穩(wěn)定[3]。艾塞那肽是人工合成的GLP-1受體激動劑,通過與其受體特異性結(jié)合發(fā)揮作用。Arakawa等[11]研究表明,Exendin-4可顯著減少單核/巨噬細(xì)胞在血管壁上的聚集,并最終抑制AS。本研究Western blotting檢測表明,非藥物干預(yù)組小鼠全程接受高脂飼料喂養(yǎng),VCAM-1、ICAM-1表達水平與其他組比較均顯著增加,表明在AS炎癥反應(yīng)過程中艾塞那肽單獨或聯(lián)合阿托伐他汀鈣片可抑制黏附分子的過度表達,從而減輕AS炎癥,延緩AS進程。在各藥物干預(yù)組中,阿托伐他汀鈣片單用和聯(lián)合艾塞那肽大劑量組的ICAM-1表達水平、阿托伐他汀鈣片聯(lián)合艾塞那肽大劑量組的VCAM-1表達水平均較普通飲食組低,表明阿托伐他汀鈣片聯(lián)合大劑量艾塞那肽抑制黏附分子表達的效果較好,為防治糖尿病合并大血管并發(fā)癥提供了依據(jù)。艾塞那肽小劑量組中VCAM-1、ICAM-1的表達水平均較其余組高,考慮與該組單獨用藥及用藥劑量較小有關(guān)。本實驗結(jié)果與Arakawa等[11]的結(jié)論一致,證實GLP-1可抑制AS的進程。

    目前普遍認(rèn)為,GLP-1的心血管保護效應(yīng)是綜合作用的結(jié)果,它可以通過改善心血管系統(tǒng)的相關(guān)危險因素如降糖、調(diào)脂等而發(fā)揮保護作用[12]。本實驗血清血脂(TC、TG、LDL-C)水平降低提示艾塞那肽可在一定程度上改善脂代謝。由于本實驗采用的ApoE-/-小鼠是非糖尿病鼠,因此在降糖及減輕胰島素抵抗上的作用表現(xiàn)并不明顯。

    綜上所述,艾塞那肽可能通過抑制ApoE-/-小鼠主動脈上VCAM-1、ICAM-1等多種細(xì)胞因子的過度表達實現(xiàn)其抗AS作用,從而抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊的形成。同時,艾塞那肽還可通過改善相關(guān)危險因素發(fā)揮對心血管系統(tǒng)的綜合保護作用。因此我們認(rèn)為,糖尿病大血管病變患者應(yīng)用GLP-1類藥物不僅可以降糖,一定程度上還可對大血管病變起到改善和延緩作用,是治療伴有大血管并發(fā)癥或合并血脂等代謝異常糖尿病患者的理想藥物。

    [1]Gerrity RG, Natarajan R, Nadler JL, et al. Diabetes-induced accelerated atherosclerosis in swine[J]. Diabetes, 2001, 50(7): 1654-1665.

    [2]Renard CB, Kramer F, Johansson F, et al. Diabetes and diabetesassociated lipid abnormalities have distinct effects on initiation and progression of atherosclerotic lesions[J]. J Clin Invest, 2004, 114(5): 659-668.

    [3]Jin YC, Shen CA, Chai JK, et al. Progress of researches on the structure and biological effects of glucagon-like peptide-1[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(8): 875-878. [金玉翠, 申傳安, 柴家科, 等. 胰高血糖素樣肽-1的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)作用研究進展[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(8): 875-878.]

    [4]Viswanathan P, Chaudhuri A, Bhatia R, et al. Exenatide therapy in obese patients with type 2 diabetes mellitus treated with insulin[J]. Endocr Pract, 2007, 13(5): 444-450.

    [5]Klonoff DC, Buse JB, Nielsen LL, et al. Exenatide effects on diabetes, obesity, cardiovascular risk factors and hepatic biomarkers in patients with type 2 diabetes treated for 3 years[J]. Curr Med Res Opin, 2008, 24(1): 275-286.

    [6]Goyal S, Kumar S, Bijjem KV, et al. Role of glucagon-like peptide-1 in vascular endothelial dysfunction[J]. Indian J Exp Biol, 2010, 48(1): 61-69.

    [7]Calixto JB, Campos MM, Otuki MF, et al. Anti-inflammatory compounds of plant origin. Part Ⅱ. Modulation of proinflammatory cytokines, chemokines and adhesion molecules[J]. Planta Med, 2004, 70(2): 93-103.

    [8]Kitagawa K, Matsumoto M, Sassaki T, et al. Involvement of ICAM-1 in the progression of atherosclerosis in apoE-knockout mice[J]. Atherosclerosis, 2002, 160(2): 305-310.

    [9]Lu SF, Chen JY. Relationship between intercellular adhesion molecule 1 and macrovascular complications of type 2 diabetes mellitus[J]. Zhejiang Prev Med, 2007, 19(5): 59-61. [盧曙芳,陳建悅. 細(xì)胞間黏附分子1與2型糖尿病大血管病變的關(guān)系[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué), 2007, 19(5): 59-61.]

    [10]Zhang JX, Xiang GD, Sun HL, et al. Effect of α-lipoic acid in inhibiting the expression of intercellular adhesion molecule-1 in human umbilical vein endothelial cells under high glucoseconcentration[J]. Med J Chin PLA, 2009, 34(11): 1353-1355. [張軍霞, 向光大, 孫慧伶, 等. α-硫辛酸對高糖作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 34(11): 1353-1355.]

    [11]Arakawa M, Mita T, Azuma K, et al. Inhibition of monocyte adhesion to endothelial cells and attenuation of atherosclerotic lesion by a glucagon-like peptide-1 receptor agonist, exendin-4[J]. Diabetes, 2010, 59(4): 1030-1037.

    [12]Liu L, Yan ZX. Protective effects of glucagon-like peptide-1 on cardiovascular system[J]. Chin Med Her, 2011, 8(21): 5-7. [劉琳, 嚴(yán)宗遜. 胰高血糖素樣肽-1對心血管系統(tǒng)的保護效應(yīng)[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2011, 8(21): 5-7.]

    Effects of exenatide on expression of VCAM-1, ICAM-1 in ApoE-knock-out mice with atherosclerosis

    CHEN Ruo-ran1, LIANG Lin-lang2*, WANG Jian-mei2, WANG Yu2
    1Postgraduate Training Base of General Hospital of Shenyang Command, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121000, China
    2Department of Endocrinology, General Hospital of Shenyang Command, Shenyang 110016, China
    *

    , E-mail: lianglllj@sina.com

    ObjectiveTo investigate the effect of exenatide, a glucagon-like peptide-1 receptor agonist, on aortic lesions in ApoE-knock-out (ApoE-/-) mice with atherosclerosis.MethodsApoE-/-mice were randomly divided into normal diet group (n=14) and high-fat diet group (n=68). After fed for 12 weeks, 4 from normal diet group and 8 from high-fat diet group were randomly chosen for verification of model reproductions. Then the mice in high-fat diet group were divided into 6 groups (10 each): nondrug intervention group, atorvastatin group, exenatide low/high-dose groups and atorvastatin + exenatide low/high-dose groups. After 6 weeks of drug intervention, blood samples were collected from the retro-orbital venous plexus of the mice. All the mice were sacrificed by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital, and paraffin sections of the aortic arch was processed for HE staining. The serum lipid level was measured by ELISA, the protein expressions of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) were determined by Western blotting.ResultsHE staining showed that the histology of the aorta of mice in normal diet group and atorvastatin + exenatide high-dose group were normal, but those of atorvastatin group and exenatide low/high-dose groups and atorvastatin + exenatide low-dose group showed extensive pathological thickening of endometrium. Lipid plaques were formed with visible lipid cores in the aorta of mice in non-drug intervention group. Application of exenatide alone or combined with atorvastatin reduced the levels of serum lipid (TC, TG, LDL-C) in varying degrees (P<0.05). Different doses of exenatide alone or in combination with atorvastatin reduced the expression of VCAM-1, ICAM-1 in aorta (P<0.05).ConclusionsExenatide may inhibit the formation of atherosclerotic lesions by down-regulating the expression of VCAM-1, ICAM-1 in aorta of ApoE-/-mice.

    R541.4

    A

    0577-7402(2013)06-0467-05

    2013-03-04;

    2013-04-15)

    (責(zé)任編輯:張小利)

    陳若然,碩士研究生。主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究

    121000 遼寧錦州 遼寧醫(yī)學(xué)院沈陽軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地(陳若然);110016 沈陽 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科(梁琳瑯、王健美、王宇)

    梁琳瑯,E-mail:lianglllj@sina.com

    猜你喜歡
    艾塞那鈣片高脂
    阿司匹林片與阿托伐他汀鈣片對腦梗死的治療效果
    高脂血標(biāo)本對臨床檢驗項目的干擾及消除對策
    實力坑娃
    運動降低MG53表達及其在緩解高脂膳食大鼠IR中的作用
    艾塞那肽治療2型糖尿病臨床觀察
    艾塞那肽誘導(dǎo)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞損傷機制的實驗研究
    艾塞那肽對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用研究
    高脂飲食誘導(dǎo)大鼠生精功能障礙
    阿托伐他汀鈣片治療心絞痛療效分析
    阿托伐他汀鈣片口服致肌酶升高2例
    伊人久久精品亚洲午夜| 长腿黑丝高跟| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久久国产成人免费| 亚洲人成网站在线播| 亚洲在线观看片| 观看免费一级毛片| 大香蕉久久网| 色网站视频免费| 国产av在哪里看| 久久久久久久久久黄片| 最近手机中文字幕大全| 内地一区二区视频在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费观看人在逋| 水蜜桃什么品种好| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产视频首页在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 人人妻人人看人人澡| 亚洲成人久久爱视频| 18+在线观看网站| 韩国av在线不卡| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲国产精品成人综合色| 免费看美女性在线毛片视频| 日韩av在线大香蕉| 日韩欧美精品免费久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 午夜福利视频1000在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 国产乱来视频区| 少妇熟女欧美另类| 久热久热在线精品观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品酒店卫生间| 国产精品福利在线免费观看| 一个人免费在线观看电影| 免费在线观看成人毛片| 国产精品不卡视频一区二区| 久久亚洲精品不卡| 国产高清国产精品国产三级 | 国产成人精品一,二区| 亚洲成色77777| av国产免费在线观看| 国产成年人精品一区二区| 美女内射精品一级片tv| 直男gayav资源| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 精品久久久久久成人av| 国产精品1区2区在线观看.| 国产不卡一卡二| 国产黄色小视频在线观看| 热99re8久久精品国产| 免费观看精品视频网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产亚洲91精品色在线| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免| 久久久久久久久久久丰满| 国产日韩欧美在线精品| av在线亚洲专区| 亚洲av二区三区四区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久亚洲精品不卡| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲av一区综合| 性色avwww在线观看| 久久人人爽人人片av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲人成网站在线观看播放| 少妇高潮的动态图| 色网站视频免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 美女国产视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久精品人妻少妇| 男人舔奶头视频| 欧美区成人在线视频| 亚洲国产欧美在线一区| 三级国产精品欧美在线观看| 久久久久国产网址| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产乱人视频| 国产视频内射| 好男人在线观看高清免费视频| 老女人水多毛片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费无遮挡裸体视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 两个人的视频大全免费| 国产三级中文精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲欧美精品专区久久| 国产成人91sexporn| 我要看日韩黄色一级片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久精品91蜜桃| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲中文字幕日韩| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲av免费在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产一区二区三区av在线| av天堂中文字幕网| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 在线观看66精品国产| 亚洲经典国产精华液单| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美3d第一页| 性插视频无遮挡在线免费观看| 嫩草影院精品99| 搡老妇女老女人老熟妇| 少妇丰满av| 国产视频内射| 99久国产av精品| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品精品国产色婷婷| 国产免费视频播放在线视频 | 一级毛片电影观看 | 免费在线观看成人毛片| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产久久久一区二区三区| av国产免费在线观看| 色网站视频免费| 亚洲av日韩在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲av福利一区| 91久久精品国产一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 舔av片在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久网色| 欧美色视频一区免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产亚洲一区二区精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产淫片久久久久久久久| av女优亚洲男人天堂| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品久久久久久久久免| 欧美另类亚洲清纯唯美| 如何舔出高潮| 尾随美女入室| 看免费成人av毛片| 日韩人妻高清精品专区| 看非洲黑人一级黄片| 亚州av有码| 一级毛片我不卡| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费观看的影片在线观看| 国产69精品久久久久777片| 国产成人a区在线观看| 久久久久久久国产电影| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产成人一区二区在线| 看十八女毛片水多多多| 成人毛片60女人毛片免费| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲av日韩在线播放| 老司机影院毛片| 秋霞伦理黄片| 国产精品蜜桃在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产人妻一区二区三区在| 国产单亲对白刺激| 欧美成人免费av一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲在线自拍视频| 欧美高清成人免费视频www| 夜夜爽夜夜爽视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品一二三区在线看| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲av成人精品一二三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久久久久久黄片| 97超视频在线观看视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 麻豆久久精品国产亚洲av| 18+在线观看网站| 成人欧美大片| 成人欧美大片| a级一级毛片免费在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 99热这里只有是精品50| 国产久久久一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产一级毛片在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 婷婷色av中文字幕| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久久久久国产电影| 亚洲人成网站在线播| 高清在线视频一区二区三区 | 国产亚洲精品av在线| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 看片在线看免费视频| 2022亚洲国产成人精品| 欧美性感艳星| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 国产免费福利视频在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日本一二三区视频观看| 日韩欧美国产在线观看| 精品酒店卫生间| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品精品国产色婷婷| 精品无人区乱码1区二区| 免费人成在线观看视频色| 久久精品91蜜桃| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲五月天丁香| 直男gayav资源| 三级经典国产精品| av在线观看视频网站免费| 91久久精品国产一区二区成人| 联通29元200g的流量卡| 日本色播在线视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 色综合色国产| 国产成人免费观看mmmm| 国产成人a∨麻豆精品| 99热6这里只有精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 九九在线视频观看精品| 我的女老师完整版在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久久久中文| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品久久国产蜜桃| 最近2019中文字幕mv第一页| 看片在线看免费视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品综合一区二区三区| 国产美女午夜福利| 国产伦精品一区二区三区四那| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产成人福利小说| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品永久免费网站| 少妇的逼水好多| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产亚洲精品久久久com| 国产色爽女视频免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久久久久久久久久丰满| 亚洲成色77777| 亚洲av男天堂| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲在线自拍视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | h日本视频在线播放| 日韩制服骚丝袜av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 51国产日韩欧美| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲欧美精品专区久久| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲国产精品合色在线| 日本色播在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产久久久一区二区三区| 色网站视频免费| 国产高清视频在线观看网站| 成人av在线播放网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久午夜欧美精品| 免费观看人在逋| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 三级经典国产精品| 只有这里有精品99| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产单亲对白刺激| 日本免费在线观看一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 好男人在线观看高清免费视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久午夜欧美精品| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品久久久噜噜| 国产精品一区二区性色av| 亚洲国产欧美在线一区| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品熟女少妇av免费看| 五月玫瑰六月丁香| 免费黄色在线免费观看| 色5月婷婷丁香| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜免费激情av| 可以在线观看毛片的网站| 欧美日韩在线观看h| 69av精品久久久久久| 91精品国产九色| 亚洲av成人精品一二三区| 两个人视频免费观看高清| videossex国产| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 嫩草影院精品99| 国产成人精品婷婷| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日韩国产亚洲二区| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品夜色国产| 大香蕉久久网| 精品一区二区免费观看| 性色avwww在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品.久久久| 我的女老师完整版在线观看| 国产真实乱freesex| 赤兔流量卡办理| 国产不卡一卡二| 最后的刺客免费高清国语| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品,欧美精品| 99久久无色码亚洲精品果冻| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久热精品热| 亚洲色图av天堂| 国产极品天堂在线| 国产精品精品国产色婷婷| 国产久久久一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 国国产精品蜜臀av免费| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费人成在线观看视频色| 亚洲怡红院男人天堂| 色视频www国产| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产亚洲最大av| 免费观看精品视频网站| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品夜色国产| 在线a可以看的网站| 99九九线精品视频在线观看视频| 特大巨黑吊av在线直播| 国产乱人视频| av卡一久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美bdsm另类| 秋霞在线观看毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 不卡视频在线观看欧美| 日韩三级伦理在线观看| 国产一级毛片在线| 亚洲av日韩在线播放| 岛国在线免费视频观看| 看黄色毛片网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 又爽又黄无遮挡网站| 国内精品美女久久久久久| 中国国产av一级| 日韩欧美国产在线观看| 日韩欧美精品v在线| 国产淫片久久久久久久久| 在线a可以看的网站| av免费在线看不卡| 91久久精品电影网| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品嫩草影院av在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 超碰97精品在线观看| 亚洲成人av在线免费| 成年女人永久免费观看视频| 国产一级毛片在线| 天堂中文最新版在线下载 | 欧美色视频一区免费| 亚洲在久久综合| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久6这里有精品| 成人综合一区亚洲| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | av国产久精品久网站免费入址| 亚洲成av人片在线播放无| 高清日韩中文字幕在线| 欧美丝袜亚洲另类| 国产精品一区二区在线观看99 | 青青草视频在线视频观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费大片18禁| 女人久久www免费人成看片 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 99热6这里只有精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费看av在线观看网站| 午夜a级毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩制服骚丝袜av| 天堂网av新在线| 精品久久国产蜜桃| 色5月婷婷丁香| 91在线精品国自产拍蜜月| 少妇高潮的动态图| 亚洲综合精品二区| 国产高潮美女av| 在线免费观看不下载黄p国产| 波多野结衣高清无吗| 人妻系列 视频| 日本与韩国留学比较| 亚洲成人av在线免费| 免费搜索国产男女视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品,欧美精品| 如何舔出高潮| 亚洲av男天堂| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美一区二区亚洲| 黄色一级大片看看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成年女人看的毛片在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 一区二区三区高清视频在线| 桃色一区二区三区在线观看| 成人国产麻豆网| 国产在线一区二区三区精 | 晚上一个人看的免费电影| 久久亚洲精品不卡| 天堂网av新在线| 九九热线精品视视频播放| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品久久久久久久末码| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜激情福利司机影院| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲图色成人| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产在线男女| 国产高清有码在线观看视频| 在线天堂最新版资源| 成人性生交大片免费视频hd| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美丝袜亚洲另类| 热99在线观看视频| 成人综合一区亚洲| 欧美一区二区亚洲| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久热精品热| 99久国产av精品| 99热网站在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 97热精品久久久久久| 两个人的视频大全免费| 干丝袜人妻中文字幕| 精品国产三级普通话版| 欧美97在线视频| 国产视频首页在线观看| 女人久久www免费人成看片 | 国产三级在线视频| 亚洲图色成人| 精品久久国产蜜桃| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品女同一区二区软件| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲成人av在线免费| 亚洲美女视频黄频| 人妻系列 视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 日本免费在线观看一区| 亚洲国产精品成人综合色| 伊人久久精品亚洲午夜| 最近视频中文字幕2019在线8| 日韩一区二区视频免费看| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产午夜精品论理片| 少妇的逼好多水| 午夜久久久久精精品| 精品国产三级普通话版| 色尼玛亚洲综合影院| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久成人免费电影| 内地一区二区视频在线| 日韩中字成人| 最近2019中文字幕mv第一页| 日本五十路高清| 亚洲av不卡在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产视频内射| 91aial.com中文字幕在线观看| 少妇熟女欧美另类| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美精品一区二区大全| 久久久久性生活片| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人av在线播放网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 久久久精品欧美日韩精品| 精品久久久噜噜| 亚洲国产欧美人成| 欧美日本视频| 久久久精品欧美日韩精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩三级伦理在线观看| 老女人水多毛片| 日韩三级伦理在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 丝袜喷水一区| 国产av在哪里看| 免费黄色在线免费观看| 婷婷色麻豆天堂久久 | 国产探花极品一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 国产毛片a区久久久久| 国产免费视频播放在线视频 | 国产综合懂色| 热99在线观看视频| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲中文字幕日韩| 免费观看性生交大片5| 亚洲色图av天堂| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品国产露脸久久av麻豆 | 看非洲黑人一级黄片| av线在线观看网站| 免费观看a级毛片全部| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人国产麻豆网| 九九爱精品视频在线观看| 美女国产视频在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲自偷自拍三级| 联通29元200g的流量卡| 91久久精品国产一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 亚洲国产精品成人久久小说| 婷婷色麻豆天堂久久 | av国产免费在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| av在线天堂中文字幕| 黄色配什么色好看| 成人无遮挡网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品久久电影中文字幕| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产一级毛片在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 能在线免费观看的黄片| 免费无遮挡裸体视频| 乱人视频在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久午夜欧美精品| 大香蕉97超碰在线| 乱人视频在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费黄网站久久成人精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲欧美日韩东京热| 91久久精品国产一区二区三区| 国产成人a区在线观看| 久久久成人免费电影| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美日本亚洲视频在线播放|