自噬對(duì)大腸癌LoVo/Adr細(xì)胞多藥耐藥性的影響

馬強(qiáng)，常宗宏，王彪猛，王維，鄧尚新

自噬對(duì)大腸癌LoVo/Adr細(xì)胞多藥耐藥性的影響

馬強(qiáng)，常宗宏，王彪猛，王維，鄧尚新

目的探討大腸癌耐藥LoVo/Adr細(xì)胞自噬狀態(tài)對(duì)多藥耐藥(MDR)的影響。方法體外培養(yǎng)LoVo/Adr細(xì)胞，應(yīng)用透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體形成情況，采用MDC熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)定量分析自噬率，MTT法測(cè)定細(xì)胞對(duì)阿霉素(ADR)的半數(shù)抑制濃度(IC50)，RT-PCR檢測(cè)MDR1基因的mRNA水平，Western blotting檢測(cè)P糖蛋白(P-gp)表達(dá)水平。結(jié)果LoVo/Adr細(xì)胞中可見(jiàn)散在自噬體或點(diǎn)狀綠色熒光分布，自噬率為3.1%±0.5%；ADR和雷帕霉素(RAPA)單獨(dú)作用時(shí)，自噬體明顯增多，自噬率分別為33.6%±5.1%和45.2%±6.1%(P＜0.05)，ADR和RAPA聯(lián)合作用時(shí)可見(jiàn)大量自噬體形成，自噬率為76.2%±7.4%，顯著高于二者單獨(dú)作用時(shí)(P＜0.05)；LoVo/Adr細(xì)胞對(duì)ADR的IC50為3.05±0.52mg/L，RAPA作用后IC50降至1.12±0.21mg/L(P＜0.01)，RAPA具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，逆轉(zhuǎn)倍率為2.26倍；LoVo/Adr細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp蛋白呈高表達(dá)，在RAPA作用下，MDR1 mRNA表達(dá)量由1.42±0.31降至0.54±0.20(P＜0.05)，P-gp蛋白表達(dá)量由0.67±0.14降至0.15±0.08(P＜0.01)，RAPA顯著下調(diào)了MDR1 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)論多藥耐藥的LoVo/Adr細(xì)胞呈低自噬狀態(tài)，RAPA可通過(guò)提高細(xì)胞的自噬活性而逆轉(zhuǎn)MDR，逆轉(zhuǎn)途徑可能與促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡和下調(diào)MDR1基因的表達(dá)有關(guān)。

自噬；多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)類(lèi)；P糖蛋白；結(jié)直腸腫瘤

大腸癌是消化道常見(jiàn)腫瘤，術(shù)后化療引起多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)分子結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的化療藥物產(chǎn)生的交叉耐藥[1-2]。如何逆轉(zhuǎn)MDR是大腸癌治療中亟待解決的問(wèn)題。作為細(xì)胞死亡的一種方式，自噬(autophagy)與腫瘤耐藥的關(guān)系越來(lái)越引起人們的關(guān)注[3-4]。本研究以此為切入點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬活性觀察大腸癌多藥耐藥LoVo/Adr細(xì)胞對(duì)阿霉素(ADR)敏感性的變化，探討自噬對(duì)大腸癌MDR的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 多藥耐藥LoVo/Adr細(xì)胞株由本研究組采用ADR濃度遞增法誘導(dǎo)大腸癌敏感株LoVo細(xì)胞構(gòu)建，能在1.0mg/L ADR培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，具有多藥耐藥特性[5]。小牛血清(杭州四季青生物制品研究所)；RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)；DAB Kit試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)；兔抗P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(德國(guó)寶靈曼公司)；ADR、噻唑藍(lán)(MTT)、西羅莫司(雷帕霉素，RAPA)和單丹磺酰戊二胺(MDC，Sigma公司)；青霉素和鏈霉素(華北制藥廠)；Model 550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、垂直式電泳儀及濕轉(zhuǎn)裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)；FACS-420型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter公司)；日立H-600Ⅳ透射電鏡(日本日立公司)。MDR1引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LoVo/Adr細(xì)胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%熱滅活小牛血清、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI 1640，在培養(yǎng)體系中加入終濃度為1.0mg/L的ADR以維持耐藥。每48h換液1次，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 電鏡及熒光顯微鏡下觀察LoVo/Adr細(xì)胞自噬體變化 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ADR組、RAPA組和ADR+RAPA組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LoVo/Adr細(xì)胞，消化后以每孔6×104個(gè)細(xì)胞加入到24孔板(150μl/孔)中，各組細(xì)胞加用相應(yīng)藥物(ADR終濃度3mg/L，RAPA終濃度50μmol/L)培養(yǎng)24h，胰酶消化，PBS洗5min×3次，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，系列乙醇脫水，氧化丙烯浸透，環(huán)氧樹(shù)脂包埋并制成切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。將上述各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h，PBS洗2次，加入0.1mmol/L MDC，37℃培養(yǎng)箱孵育2h，熒光顯微鏡下觀察，攝片，熒光顯微鏡加用488nm發(fā)射濾片和570nm阻斷濾片。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)定量分析LoVo/Adr細(xì)胞自噬率將上述各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，MDC染色，上流式細(xì)胞儀，以488nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定3000個(gè)細(xì)胞，MDC陽(yáng)性細(xì)胞率即為自噬率，結(jié)果用Cellquest軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測(cè)RAPA對(duì)LoVo/Adr細(xì)胞ADR敏感性的影響 將LoVo/Adr細(xì)胞分為對(duì)照組和RAPA組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LoVo/Adr細(xì)胞，消化后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞加入到96孔板(200μl/孔)中。RAPA組ADR給藥前1h加入終濃度50μmol/L的RAPA，ADR終濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、 1.28、2.56、5.12mg/L共9個(gè)濃度梯度，每孔設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后取出，加入MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4h，棄培養(yǎng)基，加入DMSO，37℃保溫箱中放置10min，取出震蕩幾秒鐘，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光度(A)值，重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算ADR對(duì)LoVo/Adr細(xì)胞的抑制率。以藥物濃度為橫軸，存活率為縱軸繪制濃度效應(yīng)曲線，確定半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)RAPA對(duì)MDR1基因表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和RAPA組。細(xì)胞培養(yǎng)方法及加藥情況同1.2.4，再培養(yǎng)24h后，采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA。引物按文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)合成。MDR1：正義5'-AAGCTTAGTACCAAAGAGGCTCTG-3'，反義5'-GGCTAGAAACAATAGTGAAAACAA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為243bp；β2-微球蛋白(β2-MG)：正義5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，反義5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為115bp。RT-PCR參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。50℃反轉(zhuǎn)錄30min后行PCR反應(yīng)：94℃ 30s，52℃ 30s，60℃ 45s，共35個(gè)循環(huán)；60℃延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，在含有溴化乙啶(EB，終濃度為0.5μg/ml)的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，激光密度掃描儀掃描凝膠，用Gelbase/Gelblotpro軟件進(jìn)行分析，以β2-MG作為內(nèi)參照對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)RAPA對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞分組同1.2.4，加入適量裂解液提取蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白量并定量，使各組蛋白濃度一致，行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗以及β-actin的一抗4℃孵育過(guò)夜，加入二抗孵育1h，TBST室溫洗膜5min×3次，DAB顯色，照相。條帶經(jīng)Quantity One軟件分析并計(jì)算A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡下LoVo/Adr細(xì)胞的自噬狀態(tài) 如圖1所示，對(duì)照組LoVo/Adr細(xì)胞中可見(jiàn)散在的雙層膜結(jié)構(gòu)、含胞質(zhì)成分的自噬體；分別給予自噬體激動(dòng)劑RAPA或ADR時(shí)，LoVo/Adr細(xì)胞中的自噬體較對(duì)照組顯著增多；同時(shí)加入RAPA及ADR時(shí)，細(xì)胞中出現(xiàn)大量自噬體。

圖1 電鏡下觀察LoVo/Adr細(xì)胞自噬體Fig.1 Autophagosomes in LoVo/Adr cells observed by transmission electronic microscopy

2.2 熒光顯微鏡下LoVo/Adr細(xì)胞自噬體形成情況熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示，與電鏡觀察結(jié)果基本一致：常態(tài)下對(duì)照組LoVo/Adr細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量點(diǎn)狀綠色熒光，分布于胞質(zhì)及核周；加入RAPA或ADR后，細(xì)胞中點(diǎn)狀綠色熒光顯著增多，同時(shí)加入RAPA及ADR時(shí)，細(xì)胞中出現(xiàn)大量綠色熒光。

圖2 熒光顯微鏡下觀察LoVo/Adr細(xì)胞自噬體Fig.2 Fluorescence microscopy used to confirm autophagosomes in LoVo/Adr cells

2.3 流式細(xì)胞儀定量分析LoVo/Adr細(xì)胞自噬率對(duì)照組LoVo/Adr細(xì)胞為低自噬狀態(tài)，自噬率為3.1%±0.5%，單獨(dú)應(yīng)用ADR和RAPA時(shí)自噬率均較對(duì)照組顯著增高，分別為33.6%±5.1%和45.2%±6.1%(P＜0.05)；ADR與RAPA共同作用時(shí)自噬率為76.2%±7.4%，較兩者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)顯著增高(P＜0.05)，表明二者具有協(xié)同作用(圖3)。

圖3 FCM檢測(cè)各組LoVo/Adr細(xì)胞的自噬率Fig.3 Flow cytometric analysis of autophagy rate in LoVo/Adr cells

2.4 RAPA對(duì)LoVo/Adr細(xì)胞ADR敏感性的影響LoVo/Adr細(xì)胞ADR的IC50值為3.05±0.52mg/L，加入濃度為50μmol/L的RAPA時(shí)細(xì)胞ADR的IC50值降至1.12±0.21mg/L(P＜0.01)，提示自噬激動(dòng)劑RAPA可顯著提高LoVo/Adr細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，逆轉(zhuǎn)倍率為2.26倍。

2.5 RAPA對(duì)MDR1基因表達(dá)的影響 LoVo/Adr細(xì)胞的MDR1 mRNA呈高水平表達(dá)(1.42±0.31)，加入RAPA后，其表達(dá)量顯著下降(0.54±0.20，P＜0.05，圖4)。

2.6 RAPA對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的影響 P-gp蛋白表達(dá)與MDR1 mRNA表達(dá)基本一致，在LoVo/Adr細(xì)胞中，P-gp蛋白呈高表達(dá)(0.67±0.14)，RAPA作用后P-gp蛋白表達(dá)明顯下降(0.15±0.08，P＜0.05，圖5)，表明自噬活性可影響MDR1的蛋白表達(dá)。

3 討 論

自噬又稱(chēng)為Ⅱ類(lèi)程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞對(duì)于營(yíng)養(yǎng)不足或代謝應(yīng)激作出的一種分解代謝反應(yīng)[7]。自噬的主要功能是通過(guò)降解未進(jìn)行正確折疊或發(fā)生凝聚的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡[8-9]。盡管細(xì)胞自噬的調(diào)控過(guò)程十分復(fù)雜，但是已有明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，自噬可單獨(dú)作用或與凋亡共同作用，從而影響腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性。綜合國(guó)內(nèi)外研究成果，發(fā)現(xiàn)自噬與MDR關(guān)系存在兩種截然相反的結(jié)論，如Galoian等[10]認(rèn)為自噬增強(qiáng)可逆轉(zhuǎn)耐藥，而Ahn等[11]的研究表明抑制自噬可增加藥物敏感性。為此，我們通過(guò)調(diào)控多藥耐藥的大腸癌LoVo/Adr細(xì)胞的自噬活性，觀察耐藥指數(shù)的變化，進(jìn)一步明確自噬與耐藥的關(guān)系，并探討可能的發(fā)生機(jī)制。

圖4 LoVo/Adr細(xì)胞中mdr1 mRNA表達(dá)的RT-PCR電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of RT-PCR amplification of mdr1 mRNAs in LoVo/Adr cells

圖5 LoVo/Adr細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)的Western blotting檢測(cè)Fig.5 Protein expression of P-gp in LoVo/Adr cells by Western blotting

RAPA是mTOR特異性抑制劑，具有阻止mTOR通路、促進(jìn)自噬的作用，是特異性的自噬激動(dòng)劑[12]。本研究首先通過(guò)RAPA干預(yù)耐藥LoVo/Adr細(xì)胞，再定性及定量地觀察細(xì)胞的自噬活性，結(jié)果表明，耐藥LoVo/Adr細(xì)胞呈低自噬狀態(tài)，單獨(dú)給予ADR或RAPA時(shí)，均可使細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，而二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有協(xié)同作用。雖然ADR與RAPA均可引起細(xì)胞的自噬活性增強(qiáng)，但其機(jī)制不同：自噬是細(xì)胞的一種防御應(yīng)激反應(yīng)，ADR作為不良刺激增強(qiáng)了細(xì)胞的防御機(jī)制，表現(xiàn)為自噬活性增加，從而清除化療殺傷的一些細(xì)胞器，隔離有害物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞逃避藥物誘導(dǎo)的死亡的發(fā)生，發(fā)揮保護(hù)作用，而過(guò)度的自噬可引發(fā)自噬性死亡；RAPA作為mTOR抑制劑，可抑制mTOR通路，激活自噬，引起細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)。

進(jìn)一步觀察自噬活性變化對(duì)大腸癌LoVo/Adr細(xì)胞ADR敏感性的影響發(fā)現(xiàn)，自噬激動(dòng)劑RAPA可顯著提高LoVo/Adr細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，逆轉(zhuǎn)倍率為2.26倍，提示抑制自噬可提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，與Eum等[13]的研究結(jié)果一致。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能與RAPA通過(guò)增加自噬啟動(dòng)細(xì)胞主動(dòng)性Ⅱ型細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡，從而逆轉(zhuǎn)耐藥有關(guān)。

P-gp是耐藥細(xì)胞膜上過(guò)度表達(dá)的一種跨膜大分子糖蛋白[14]，由MDR1基因編碼，分子量為170kD，其主要功能是在細(xì)胞膜上形成一個(gè)通道，水解ATP獲得能量，將已進(jìn)入胞內(nèi)的藥物泵出胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而免遭化療藥物的殺傷[15]。為了研究自噬調(diào)控MDR是否與MDR1基因的表達(dá)有關(guān)，我們又進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明：自噬活性增高可下調(diào)MDR1基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平，從而減少細(xì)胞內(nèi)藥物的外泵，增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用，具有增敏作用。Pop等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，在多藥耐藥的B淋巴細(xì)胞系中，RAPA能使P-gp泵失活，與本研究結(jié)果類(lèi)似。

總之，本研究觀察到耐藥細(xì)胞呈低自噬狀態(tài)，ADR可通過(guò)提高耐藥細(xì)胞的自噬活性而逆轉(zhuǎn)耐藥，其逆轉(zhuǎn)途徑可能與促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡和下調(diào)mdr1基因的表達(dá)有關(guān)。由于自噬調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，很多問(wèn)題仍未闡明，甚至存在許多疑問(wèn)和矛盾，但可以證實(shí)的是調(diào)控自噬有助于恢復(fù)大腸癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，細(xì)胞自噬有望成為潛在的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的治療靶點(diǎn)。

[1] Rodrigues AS, Dinis J, Gromicho M. et al. Genomics and cancer drug resistance[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2012, 13(5): 651-673.

[2] Li L, Fu ZX, Qin Y, et al. Effects of curcumin on2-D electrophoresis profiles of proteins in drug-resistant HCT-8/ VCR cells of human colon carcinoma[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(12): 1286-1290. [李雷, 傅仲學(xué), 覃勇, 等. 姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(12): 1286-1290.]

[3] Kong D, Ma S, Liang B. et al. The different regulatory effects of p53 status on multidrug resistance are determined by autophagy in ovarian cancer cells[J]. Biomed Pharmacother, 2012, 66(4): 271-278.

[4] Bristol ML, Emery SM, Maycotte P. et al. Autophagy inhibition for chemosensitization and radiosensitization in cancer: do the preclinical data support this therapeutic strategy[J]? J PharmacolExp Ther, 2013, 344(3): 544-552.

[5] Ma Q, Zhang ZS, Wang QY, et al. Establishment and expression of multidrug resistance-related genes of human colon carcinoma LoVo/Adr cell line[J]. Chin J Dig, 2002, 22(7):412-415. [馬強(qiáng), 張振書(shū), 王群英, 等. 結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥模型LoVo/Adr的建立及其耐藥相關(guān)基因的表達(dá)[J]. 中華消化雜志, 2002, 22(7): 412-415.]

[6] Stavrovskaya AA. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells[J]. Biochemistry Mosc, 2000, 65(1): 95-106.

[7] Yang JR, Hong Q, Cai GY, et al. Effects of miR-34a on regulating the autophagy of HEK293 cells miR-34a[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(2): 166-168. [楊聚榮, 洪權(quán), 蔡廣研, 調(diào)控HEK293細(xì)胞自噬作用的初步研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(2): 166-168.]

[8] Choi AM, Ryter SW, Levine B. Autophagy in human health and disease[J]. N Engl J Med, 2013, 368(7): 651-662.

[9] Han X, Li D, Lin CR, et al. Progress on autophagy[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(10): 1267-1269. [韓笑, 李丹, 林成仁.自噬研究新進(jìn)展[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(10): 1267-1269.]

[10] Galoian K, Temple HT, Galoyan A. mTORC1 inhibition and ECM-cell adhesion-independent drug resistance via PI3K-AKT and PI3K-RAS-MAPK feedback loops[J]. Tumour Biol, 2012, 33(3): 885-890.

[11] Ahn JH, Lee M. Suppression of autophagy sensitizes multidrug resistant cells towards Src tyrosine kinase specific inhibitor PP2[J]. Cancer Lett, 2011, 310(2): 188-197.

[12] Kimmelman AC. The dynamic nature of autophagy in cancer[J]. Genes Dev, 2011, 25(19): 1999-2010.

[13] Eum KH, Lee M. Targeting the autophagy pathway using ectopic expression of Beclin 1 in combination with rapamycin in drugresistant v-Ha-ras-transformed NIH 3T3 cells[J]. Mol Cells, 2011, 31(3): 231-238.

[14] Ma SR. K+channel and malignant tumor of digestive tract[J]. Chin J Pract Intern Med, 2006, 26(24): 1934-1936. [麻樹(shù)人. 鉀離子通道與消化道惡性腫瘤[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2006, 26(24): 1934-1936.]

[15] Breier A, Gibalova L, Seres M, et al. New insight into p-glycoprotein as a drug target[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2013, 13(1): 159-170.

[16] Pop IV, Pop LM, Ghetie MA, et al. Targeting mammalian target of rapamycin to both downregulate and disable the P-glycoprotein pump in multidrug- resistant B-cell lymphoma cell lines[J]. Leuk Lymphoma, 2009, 509(7): 1155-1162.

Effects of autophagy on multidrug resistance of drug resistant LoVo/Adr cells of colon carcinoma

MA Qiang, CHANG Zong-hong, WANG Biao-meng, WANG Wei, DENG Shang-xin
Department of Gastroenterology, General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China

ObjectiveTo observe the effects of autophagy on multidrug resistance (MDR) of drug resistant LoVo/Adr cells of colon carcinoma.MethodsThe formation of autophagosomes was monitored with transmission electron microscopy, and autophagy rate was measured with the aid of MDC staining and flow cytometry. IC50value of adriamycin (ADR) on colon carcinoma cells was detected by MTT assay. The mRNA level of MDR1 gene was measured by RT-PCR, and P-gp protein expression was detected by Western blotting.ResultsThe sporadic autophagosomes or green epoptic dots were found to distribute in LoVo/ Adr cells with an autophagy rate of 3.1%±0.5%. A large number of autophagosomes were seen after being treated with ADR or rapamycin (RAPA) with the autophagy rates of 33.6%±5.1% and 45.2%±6.1%, respectively (P＜0.05). After being treated with ADR combining RAPA, autophagosomes appeared abundantly with an autophagy rate of 76.2%±7.4%, which was significantly higher than that when treated with ADR or RAPA alone (P＜0.05). The IC50value of LoVo/Adr cells on ADR was 3.05±0.52mg/L, which decreased to 1.12±0.21mg/L after being treated with RAPA (P＜0.01). RAPA could reverse MDR with a reversal ratio of 2.26. High expression of mRNA and protein of MDR1 gene were observed in LoVo/Adr cells. When treated with RAPA, the expression of MDR1 mRNA decreased from 1.42±0.31 to 0.54±0.20 (P＜0.05), and the expression of P-gp protein also decreased significantly from 0.67±0.14 to 0.15±0.08 (P＜0.01).ConclusionMDR LoVo/Adr cell shows a low autophagic activity, and RAPA can reverse MDR by increasing autophagy activity. The reversal path might be related with the increase of cell autophagic death and the decrease in MDR1 gene expression in LoVo/Adr cells.

autophagy; multidrug resistance-associated proteins; P-glycoprotein; colorectal neoplasms

R735.35

A

0577-7402(2013)11-0900-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.11.007

2013-06-27；

2013-9-03)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

馬強(qiáng)，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師。主要從事大腸癌疾病的基礎(chǔ)及臨床研究工作

730050 蘭州軍區(qū)總醫(yī)院消化科(馬強(qiáng)、常宗宏、王彪猛、王維、鄧尚新)